董 妍,胡文忠,姜爱丽,冯 可,吕晓萌,纪懿芳

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024;4.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)



食源性大肠杆菌快速检测技术研究进展

董 妍1,胡文忠2,*,姜爱丽2,冯 可3,吕晓萌4,纪懿芳1

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024;4.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),其中有少数血清型可引起食源性疾病,对人类生命健康产生很大危害。因此,研究快速、灵敏、特异的食源性大肠杆菌检测方法对有效保障食品安全有着重要意义。本文对食源性大肠杆菌快速检测技术的研究进展进行了综述。

大肠杆菌,检测技术,快速

1855年Theodor Escherich首次分离出大肠埃希氏菌,也称大肠杆菌。大肠杆菌大多数是人或动物肠道中的重要的寄生菌,不具有致病性,但少数大肠杆菌具有致病性,可引起人类疾病。根据生物特性可将其分成五类:肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhageE.coli,EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli,EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EnteroinvasiveE.coli,EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EnteroaggregativeE.coli,EAEC)。大肠杆菌在食品卫生质量监测中可作为指示菌,在环境卫生不良的情况下,大肠杆菌有可能污染农业用水,继而污染农产品,造成食品安全疾病的暴发。

长期以来,我国乃至世界范围内暴发的食品安全事件中,有很大比例是由食源性大肠杆菌引发的。2011年,德国因食用携带大肠杆菌O104∶H4的芽菜而暴发了大肠杆菌疫情;同年美国因食用被大肠杆菌O157∶H7污染的草莓而发生感染事件;2012年,加拿大暴发大规模的大肠杆菌疫情,源头为牛肉产品;2013年,美国暴发大规模大肠杆菌疫情,反映了相关多种食品的加工方面存在严重的安全控制缺陷;2014年,苏格兰因食用疑似被污染的汉堡发生大肠杆菌疫情[1]。大肠杆菌不但通过水源、食物传播而引起人类疾病,而且还会因全球贸易交流给社会经济带来风险。由此可见,为保障人类健康和减轻经济贸易损失,研究开发准确、快速的食源性大肠杆菌检测技术是十分必要的。因此,本文从免疫学、分子生物学等方面,对食源性大肠杆菌检测技术进行了综述。

1 免疫学检测技术

1.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术(ELISA)就是通过抗原和抗体特异性结合,产生显色反应的有色产物来定性或定量分析。近年来ELISA检测方法不断改良,其灵敏度、稳定性、检测速度也在不断提高,同时,ELISA方法易受待测物质含量、免疫原性、稳定性、结构等诸多因素干扰,对试剂选择性高的问题也不容忽视。Ge[2]等人建立一种方法对大肠杆菌O157∶H7及其他产志贺毒素大肠杆菌进行了检测,主要是用ELISA方法检测产志贺毒素大肠杆菌DNA的PCR扩增产物,与普通PCR相比,灵敏度提高100倍,整个过程约6h,应用于碎牛肉的检测限为105CFU/g。Galikowska[3]等人应用ELISA方法检测大肠杆菌O157∶H7等多种大肠杆菌,此方法用噬菌体代替了抗体,灵敏度为106cells/mL。

1.2 免疫层析技术

免疫层析技术主要是经毛细管作用,使待测样品中的抗原或抗体与包被有已知抗原或抗体的微孔滤膜载体结合,通过标记物标记达到定性检测目的,其特点是方便快速、适用性广、稳定、易于判读,但其灵敏度有待提高。Park[4]等人应用免疫层析技术对包含大肠杆菌O157∶H7在内的四种菌进行了多重检测,大肠杆菌O157∶H7的检测范围为1.2×105～1.2×107CFU/mL,检测在20min内完成。Yonekita[5]等人开发了专用于检测产志贺毒素大肠杆菌O26的免疫层系试纸条,检测限为2.2×103～1.0×105CFU/mL,并应用于人工污染的牛肉、萝卜芽等食物样本中,经18h増菌后检出限大约为1CFU/25g,与PCR检测结果100%一致。CUI[6]等人应用胶体金免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测大肠杆菌O157∶H7,检测限为7.6×103CFU/mL,将10CFU/g大肠杆菌O157∶H7接种于食品样本中,检测时间小于72min。

1.3 量子点荧光探针技术

量子点在受到激发后具有优良的荧光性能,与相关抗体结合可成为特异性荧光探针,再与目标菌免疫结合而形成荧光免疫复合物,通过复合物的荧光强度测定出目标菌的浓度。量子点具有荧光发射波长可控、量子效率高、光稳定性好等特点[7],量子点标记技术具有快速、灵敏的优点。Mitchell[8]等人应用量子点标记技术检测大肠杆菌O157∶H7,检测限为49×10-15mol/L。Sanvicens[9]等人用量子点标记anti-IgG抗体阵列检测三明治中的大肠杆菌O157∶H7,未富集样品的检测限低于10CFU/mL,比ELISA方法的检测限提高了三个数量级。

2 分子生物学检测技术

2.1 常规PCR

PCR技术是在短时间内对特定DNA序列在体外进行大量扩增。常规PCR对扩增产物的鉴定主要是通过电泳技术[10],其特点是微量、快速、特异性灵敏性较高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测中、但其易产生假阳性结果的问题也不容忽视。Sangdee[11]等人利用肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)设计了SCAR引物来检测大肠杆菌,能够检测50pg的基因组DNA和100CFU/mL的大肠杆菌细胞,具有良好特异性。徐义刚[12]等人设计了一对双启动寡核苷酸引物对产肠毒性大肠杆菌进行PCR检测,检测灵敏度为1.24×102CFU/mL。

2.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是在反应体系中加入特定的荧光物质,可以对扩增产物进行标记跟踪,也可以对反应进行实时监控,最后根据标准曲线进行检测分析。与常规PCR方法相比,荧光定量PCR的特异性和灵敏度较高,操作简单,具有定量功能。常用的荧光定量PCR方法有染料法[13]和探针法[14]。染料法常用荧光染料如SYBR GreenⅠ,与DNA分子非特异性结合而被染色。探针法是PCR在扩增时,在加入引物的同时加入一个特异性的荧光探针,如TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等。染料法操作简单,而探针法特异性较高。Wang[15]等人针对大肠杆菌和志贺氏菌的tuf基因,确定了通用引物和探针,建立了一种应用扩增内标的双实时荧光定量PCR方法,以检测大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O111∶H8、大肠杆菌O121∶H19、志贺氏菌等多种菌,扩增效率大于96%,并应用此方法检测人工污染的原料奶,未经预増菌的检出限为102CFU/mL,经预増菌的每10mL检出限小于10CFU。Kim[16]等人针对大肠杆菌O157∶H7的eaeA基因设计引物和探针,应用荧光定量PCR检测鲜切甘蓝,増菌后检出限为1.53logCFU/mL,总时间不超过9h,扩增效率为94.17%。Khatami[17]等人针对大肠杆菌O157∶H7的stx-1基因设计引物和探针,开发了基于特异性杂交的荧光扩增PCR技术(FLASH-PCR),该技术在PCR扩增结束后将结果转化为FLASH格式,用以检测反映荧光强度的荧光信号,扩增产物为336bp,该技术具有特异、简便、快速、低污染的特点。

2.3 多重PCR

多重PCR可以同时检测多种目标菌或基因,即在同一反应体系里同时加入多对特异性引物,扩增多条DNA片段。这种方法能够极大节省检测时间、特异敏感、高效简便。但此技术存在着引物之间相互干扰、体系中易发生竞争性抑制等问题。Son[18]等人对五种毒力基因stx1、stx2、eae、ehxA、uidA建立了多重PCR方法,应用于人工污染的菠菜,苜蓿芽和香菜中,能够特异检测大肠杆菌O157∶H7和产志贺毒素的非O157大肠杆菌,检测时间约为75min,具有更广泛的检测能力。Gordillo[19]等人对大肠杆菌O157∶H7的fliCh7和rfbE基因设计特异性引物和探针,建立了双重实时PCR并应用于人工污染的肉制品,检测限为10或102CFU/g,4h増菌后,检测限降低到约1CFU/g,总时间约8h。Binet[20]等人对番茄、甜椒等六类农产品的志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌进行了多重PCR检测,检测时间小于90min,检测限1.6×103CFU/mL。

2.4 环介导等温扩增

环介导等温扩增(LAMP)是一种新型恒温核酸扩增技术,针对目的基因6个区域设计4种特异引物,恒温条件下用链置换DNA聚合酶作用15～60min,最终由扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度来鉴定,其特点是简便、特异性好、灵敏,但由于恒温条件,无法进行多重扩增,另外还要选择合适的特异引物及尽量避免反应体系受污染的问题。Wang[21]等人应用LAMP技术检测原料奶中的大肠杆菌O157,添加了叠氮溴化乙锭来选择性扩增活菌,检测限为440CFU/mL,显著低于添加叠氮溴化乙锭的PCR反应的检测限(4.4×104CFU/mL)。Wang[22]等人应用LAMP技术检测莴苣、菠菜中的产志贺毒素大肠杆菌,并模拟了表面染菌和冷藏过程,检测限为103～104CFU/g,检测时间10～45min。

2.5 基因芯片

基因芯片技术是将含待测样品PCR扩增产物的荧光标记探针与芯片上寡核苷酸点杂交,然后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来分析鉴定。Suo[23]等人对基因芯片进行了优化,并将其应用于26种包鲜肉样品中大肠杆菌O157∶H7的检测和基因分型中,在4种独立包装的样品中分离出三种不同的大肠杆菌O157∶H7。Kim[24]等人建立了分子信标基因芯片体系检测大肠杆菌O157∶H7,消除了假阴性信号的风险,样品中目的基因的检出限可降低到≤1ng/μL。陈昱[25]等人建立一种运用多重 PCR 和基因芯片技术检测大肠杆菌O157∶H7等三种致病菌的方法,此方法将三重PCR扩增产物与含特异性探针的芯片杂交,基因组DNA的检测限约为8pg,对于细菌纯培养物的检测限约为50CFU/mL。

3 红外光谱技术

红外光谱技术主要测定微生物的傅里叶变换红外光谱来获得微生物及其生物大分子结构的信息,由此鉴定微生物种类及状态。Siripatrawan[26-27]等人将红外光谱技术与化学计量学结合以检测多种大肠杆菌,在其生长期的第4h到第12h,菌数从103CFU/mL增长到1010CFU/mL,并将此法应用于检测人工污染的不同浓度大肠杆菌的菠菜中,检测结果为5.1～7.4logCFU/g。路春霞[28]等人利用红外光谱技术对大肠杆菌O157∶H7等四种食源性致病菌进行了研究,结果表明此方法对四种致病菌具有良好的区分效果,有望成为一种快速检测食源性致病菌的新方法。

4 传感器技术

传感器技术是将可识别物质的浓度转换为电信号进行检测的设备。该技术具有稳定、灵敏、快速等优点。Li[29]等人采用经二茂铁-抗菌肽结合物修饰的生物传感器检测,其灵敏度达到103CFU/mL,并对比了此传感器对大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌K12、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的选择性,发现其优先选择大肠杆菌O157∶H7。李杜娟[30]等人建立了一种采用电化学阻抗谱技术的生物传感器,它通过石英晶体金电极表面附着一层蛋白A膜来固定抗体,以达到快速检测大肠杆菌O157∶H7的目的,检测限为103CFU/mL,检测时间少于10min。Chan[31]等人将大肠杆菌O157∶H7与特异性抗体修饰的磁珠偶联,通过电化学免疫传感器中的纳米多孔膜收集,检测限为10CFU/mL。

5 其他

现阶段大肠杆菌检测技术随着科技的深入发展也得到了极大拓展,更多先进的检测技术被开发、应用,同时多技术相互联用也大大提高了对其的检测能力。噬菌体检测技术在检测食源性致病菌方面具有方便、特异、费用适中等特点;免疫分离技术常与PCR技术联用以提高实验灵敏性;PCR技术与ELISA技术结合而成的PCR-EIA技术在灵敏度、特异性等方面有着诸多优势;微生物专用酶快速反应检测技术利用大肠杆菌相关的特异性酶(β-D-葡糖醛酸糖苷酶)产生的颜色反应以鉴定大肠杆菌,此方法具有简便、快速、广泛适用等优点。Kim[32]等人应用多酶-纳米金颗粒探针检测大肠杆菌O157∶H7,检测限为102CFU/mL,检测时间1h以内。Safavieh[33]等人应用微流控芯片电化学分析方法结合环介导等温扩增定量检测大肠杆菌,检测时间1h,在LB培养基中检出菌体为24CFU/mL,检出DNA为8.6fg/μL。Jothikumar[34]等人应用等温基因指数性扩增反应检测大肠杆菌O157∶H7,检出限为20CFU/reaction。

6 展望

目前,在我国应用于国家检测标准的是传统选择性增菌、生化鉴定的检测方法,但其在检测周期及灵敏度方面都有一定局限性,随着科学技术水平的不断提高,各种新型检测技术不断被开发应用。基于分子生物学的基因检测技术能够准确检测大肠杆菌,并兼具灵敏、快速的特点,成为研究热点。对未经前增菌过程的大肠杆菌进行定量检测,能够提高检测的准确性及速度,这就给检测技术的灵敏度提出了更高的要求,同时也将是今后研究的热点之一。另外,五种致病大肠杆菌的毒力基因、发病机制、疾病表现形式也不尽相同,研究针对不同类型致病大肠杆菌的检测技术对有效保障食品安全有着重要意义,这就需要更多的依赖基因水平的研究。为有效预防食源性致病菌感染,就要建立准确、快速的检测体系来保障食品安全,虽然现阶段对大肠杆菌检测方法的研究已比较深入,并具有多层次、多角度的特点,但快速、特异、灵敏仍是大肠杆菌检测技术面临的重大课题,由此可见,食源性大肠杆菌检测技术仍有广阔的开拓空间。

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Research progress in rapid detection for foodborneEscherichiacoli

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,JIANG Ai-li2,FENG Ke3,LV Xiao-meng4,JI Yi-fang1

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China;4.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Escherichiacoliis known asE.coli. A few serotypes ofE.colican cause foodborne diseases. It’s harmful to human health. Therefore,it’s significant for establishing the rapid,sensitive and specific detection method of foodborneE.colito guarantee the food safety. In this paper,the research development of rapid detection technologies on foodborneE.coliin food was summarized.

Escherichiacoli;detection technologies;rapid

2014-05-13

董妍(1989-),女,在读硕士,研究方向:食品安全。

*通讯作者:胡文忠(1959-),男,博士，教授,研究方向:食品科学。

国家自然科学基金项目(31172009)；国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05)；大连科技计划项目(2012E13SF106)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0384-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.073