刘平平 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

禽流感(AI)是A型流感病毒(AIV)引起的禽类全身性或呼吸器官性传染病，主要侵害鸡、火鸡、鸭和鹅等。我国《家畜家禽防疫条例》和国际兽疫局动物流行病组织(OIE)规定该病为A类烈性传染病。该病的毒型众多、变异性极强、低致病性毒株能在短期内变成高致病性毒株(HPAIV)，从而给养禽业带来毁灭性打击。根据禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的变异情况，可以把它区分成很多亚型，目前已分离鉴定的AIV分为16个H亚型和10个N亚型。绝大部分禽流感病毒是无毒或低毒的，禽类感染后不表现任何临床症状，只有少数毒株才引起临床症状，甚至发生严重死亡。进入80年代以来，引起高致病力禽流感流行的主要为H5和H7亚型。高致病性禽流感的暴发和流行，常常给养禽业带来毁灭性的经济损失。本文用AIV－H7N3进行致病力检测并制成油乳剂甲醛灭活疫苗，再用此疫苗和实验室提供的H5N1、H9N2油乳剂甲醛灭活疫苗对鸡只进行免疫，并用AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9进行交叉攻毒，检测油乳剂灭活苗针对自身病毒攻击的免疫效力和针对HA亚型不同的AIV抗原的交叉保护力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 非免疫鸡胚 7日龄非免疫鸡胚孵化至9～11日龄。

1.1.2 鸡 1日龄石岐杂黄鸡在动物试验室隔离饲养至28日龄，期间不做任何免疫。

1.1.3 毒株、疫苗 AIV－H7毒株、H5N1、H9N2甲醛灭活油乳剂疫苗。

1.1.4 抗原与抗体 AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9标准抗原和抗体。

1.1.5 主要试剂 10号白油、司本-80、吐温-80、甲醛溶液、硬脂酸铝、琼脂糖、高速组织捣碎机、0.85%生理盐水、青霉素、链霉素。

1.1.6 主要仪器及设备 AllegraTm64R Centrifuge台式高速冷冻离心机、高速搅拌器Ultra-turrax、mICRO-mIXER振荡器、台式低速离心机TGL-16G。

1.1.7 其他试验材料 1ml 注射器(1 次性)若干，finnpipette digitaL10～50、50ul/200～1000ul各一只，96孔V型微量反应板，标记笔，过滤器(1次性)，西林瓶若干，打孔器，酒精灯，剪刀，镊子，棉拭子。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚平均死亡时间(mDT)的测定 参照郭玉璞(1994)的方法稍加改进。将无菌的含AIV－H7N3尿囊液用灭菌生理盐水做倍比稀释(10-2～10-9)，每一稀释度经尿囊腔途径接种5枚非免疫鸡胚，0.2ml/胚，同时设生理盐水对照，35℃培养7d。照胚2次/d，记录死亡胚数及其死亡时间，收获尿囊液测定HA效价。使所有鸡胚死亡的最高稀释倍数为病毒的最小致死剂量，mDT的计算公式：

根据最小致死量的鸡胚平均死亡时间的指标测定，鸡胚平均死亡时间(mDT)，弱毒为90h以上，中毒为60～ 90h，强毒为40～60h。

1.2.2 甲醛灭活油乳剂疫苗的制备和检测 （1）疫苗的种毒灭活：将增殖后的病毒接种普通营养琼脂培养基和麦康凯营养琼脂无菌检验合格后，测定其HA效价，选择HA效价≥29抗原用0.1%的甲醛溶液37℃作用48h灭活，并用灭活的绒毛尿囊液接种敏感鸡胚检验灭活效果。4℃下保存备用。（2）甲醛灭活油乳剂疫苗的配制方法：按照罗开健(1999)的方法配制。水相配制：将灭菌吐温-80按3%(V/V)加入灭活抗原内，搅拌混合均匀。油相配制：10号白矿油、司本-80、硬脂酸铝按94:6:2比例通过加势搅拌溶化后，121℃高压灭菌20min，置室温保存备用。疫苗配制：将水相与油相按2:3比例，先将油相倾入胶体磨中搅拌，再缓慢加入水相，加完后循环搅拌4min，使混合物充分乳化，即为乳白色的油乳剂灭活疫苗。共制备3批疫苗。（3）甲醛灭活油乳剂疫苗质量的检测：疫苗的无菌检测：将配制的疫苗接种普通培养琼脂培养基和麦康凯营养琼脂培养基，37℃温育96h，观察有无细菌生长。疫苗的外观检测：肉眼观察上述灭活疫苗的外观。疫苗的稳定性检测：取一部分疫苗置离心管中，3500r/min离心15min，观察疫苗有无分层及破乳的情况出现，并放室温继续观察。疫苗剂型检测：将以上油乳剂疫苗分别滴于冷水表面，疫苗不分散为油包水型，分散则为水包油型。疫苗的粘度检测：在室温25℃下用1ml吸管(下口内径1.2mm，上口内径2.7 mm)吸取疫苗1ml，使其垂直流出0.4ml的时间应不超过8s。疫苗的安全性检测：取5、15、28d龄石岐杂黄鸡各8只，按疫苗常规免疫剂量(5～15d龄：0.3ml/只、28d龄：0.5ml/只)的4倍即各1.2ml/只、2ml/只，在左右两边肩部肌肉注射试验鸡，观察2w，并剖杀试验鸡检查注射部位有无异常。

1.2.3 流感各亚型之间的交叉保护试验 将96只28d龄的鸡随机分成12组，每组8只；I、II、III组用H5N1油苗以0.5ml/只剂量进行免疫，免后3w分别以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9进行肌注攻毒；IV、V、VI组用H7N3油苗以 0.5ml/只剂量进行免疫，免后3w分别以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9进行肌注攻毒；VII、VIII、IX组用H9N2油苗以0.5ml/只剂量进行免疫，免后3w分别以102LD50×0.2ml 的H5、105EID50×0.5ml 的H7、105EID50× 0.2ml的H9进行肌注攻毒；X、XI、XII组用阴性尿囊液制成的油苗以0.5ml/只剂量进行免疫，免后3w 分别以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2 ml的H9进行肌注攻毒；同时设空白对照组8只。攻毒后观察10d，同时在攻毒后3d采集攻以H7、H9各组的拭子并分离病毒，观察疫苗的免疫保护效果。

2 结果

2.1 鸡胚平均死亡时间(mDT)

经测定，AIV－H7N3毒株的鸡胚平均死亡时间(mDT)为138h，根据最小致死量的鸡胚平均死亡时间的指标测定，证明AIV－H7N3毒株为弱毒株。

2.2 甲醛灭活油乳剂疫苗

疫苗的种毒灭活效果：灭活的绒毛尿囊液接种敏感鸡胚检验灭活效果为病毒已完全灭活。甲醛灭活油乳剂疫苗质量的检测结果：疫苗乳化效果良好，无分层、破乳现象，疫苗为油包水型，垂直流出0.4ml的时间没有超过8s，结果证明该疫苗是稳定的。甲醛灭活油乳剂疫苗安全性检测结果：疫苗以不同剂量接种不同日龄的鸡只均未出现不良反应，精神状态良好，食欲正常，接种部位无肿胀发热等不良反应，剖杀这些免疫鸡，注射部位也无异常反应，说明这些油乳剂疫苗对试验鸡是安全的。

2.3 流感各亚型之间的交叉保护

表1 流感各亚型之间的交叉保护试验结果

续表1

3 讨论

（1）本试验以司本-80为油相的乳化剂，硬脂酸铝为稳定剂，以吐温-80作为水相的乳化剂，水相与油相的比例为2:3，所研制的疫苗的物理性状及免疫效力均较为理想。（2）流感各亚型之间的交叉保护试验结果表明，用AI毒株所制油苗用同亚型AIV攻击均获完全保护，进一步证明了用甲醛作灭活剂制备的油乳剂灭活疫苗对同亚型AIV的感染有较强的保护作用，这为油乳剂灭活疫苗应用在生产实践中提供了良好的试验基础。而用不同亚型AIV攻击其交叉保护力，H5N1灭活疫苗在免疫后3w时对AIV－H7、AIV－H9攻击为2/8保护，H7N3免对AIV－H9攻击为2/8保护，H9N2免对AIV－H5攻击则为0/8保护，表明HA亚型不同的AIV抗原之间的交叉保护力是比较低的，其中对强毒H5N1的保护作用几乎为0。AIV亚型多且易产生变异，不同的HA亚型间缺乏良好的交叉保护性，因此单价AIV灭活疫苗在生产中的使用受到了一定的限制，现灭活苗可选用当地流行株或国际准株制成多价苗，而且亚型抗原之间不产生免疫干扰。所以，用AIV油乳剂灭活苗控制禽流感是切实可行的，必将给养禽业带来明显的经济效益。由于试验鸡只数量所限，本试验所进行的流感各亚型之间的交叉保护试验，如果将试验鸡只数量增多，可能会有其他收获，有待进一步研究