郭宏儒 （内蒙古民族大学动物科技学院 内蒙古 通辽 028043）

任秀珍* （内蒙古民族大学农学院 内蒙古 通辽）

细胞凋亡是细胞由基因控制的有序的死亡，又称为程序性的细胞死亡(programmed cell death，PCD)。抗凋亡基因BCL2家族的发现开辟了新一类癌基因—凋亡调控基因的新纪元[1]Bcl-2家族蛋白包括两类功能相反的蛋白质，一类是抑制细胞凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL、Bclw等；另一类是促进细胞凋亡的蛋白Bax、Bak、Bok等。Bcl-2 相关蛋白包含不同数量Bcl-2 保守区域(BH12 BH4)[2]。

1 材料与方法

1.1 试验动物及组织

蒙古绵羊取自于内蒙古穆斯林屠宰场。取新鲜脾脏液氮保存备用。

1.2 药品与试剂

琼脂糖、溴乙锭、总RNA提取试剂盒(Cat.NO.Z5110)购自Promega公司。反转录RT-PCR试剂盒(Cat.NO.DRR01 9A)、PCR产物纯化试剂盒、限制性内切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ、T4连接酶、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase、DNA marker 为DL2000(分子量为2000、1000、750、500、250、100)、PmD18-T载体；质粒提试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；E.coli Jm109感受态细胞为本实验是保存。

1.3 引物的设计及合成

RT-PCR引物的设计及合成：根据GeneBank 反刍动物Bcl-2和Bax的基因序列，利用计算机软件DNAStar进行基因序列的同源比较得出Bcl-2和Bax cDNA序列的保守区，根据该cDNA保守区和引物设计原则涉及两对PCR引物，Bcl-2：上游引物(P1)，下游引物(P2)，Bax上游引物(P3)，下游引物(P4)引物由上海生物工程公司合成。上游引物(P1):5ˊ-TTCGCCGAGATGTCCAGTC-3ˊ，下游引物(P2):5ˊ-ATCCCAGCCTCCGTTGTCC -3ˊ，上游引物(P3): 5ˊTCCGAGTGGCGGCTGAA-3ˊ， 下 游 引 物(P4):5ˊ-GCAG ACCGTGACCATCTTT-3ˊ。

1.4 脾组织总RNA的提取

采用Promega公司的总RNA提取试剂盒，按其说明进行。最后用无RNA酶去离子水溶解RNA沉淀，-70℃保存备用。

1.5 利用RT-PCR方法克隆Bcl-2和Bax的中间片断

1.5.1 RT-PCR反应 Bcl-2基因cDNA第一条连的合成 如上提取蒙古绵羊脾组织总RNA。反转录反应组分总体系为10µl：总RNA 4.5µl，10×RT buffer 1µl，mgCl2 (25mm)2µl，dNTP mixture(10 mm)1µl，RNase Inhibiter (40U/µl)0.25µl，AmV Reverse Transcriptase Xl (5U/µl) 0.5µl，OligdT(2.5µmol/l)0.5µl，RNase Free dH2O 0.25µl，终体积10µl。反应条件为：30℃10min，42℃ 30min，95℃5min，5℃5min，将mRNA反转录成cDNA，用作PCR模版。

1.5.2 PCR反应 PCR反应组分总体系为50µl：上述RT溶液10µl，5×PCR Buffer 10µl，TaKaRa ExTaq (5U/µl) 0.25µl ， P1(10pmol/µl)1µl ， P2(10pmol/µl)1µl ， dH2O 27.75µl，终体积50µl。 PCR反应条件为：94℃ 3min，94℃30s，61℃30s，72℃45s，35个循环。

1.5.3 Bax基因cDNA合成 Bax基因cDNA合成方法同Bcl-2基因。

1.5.4 bcl-2中间片断的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 按PCR产物纯化试剂盒先将RT-PCR扩增产物纯化，然后用T4连接酶将纯化的bcl-2基因cDNA片断与PmD18-T载体连接，连接产物转化Jm109 感受态细胞后，在含X-gal、IPTG的LB平板培养基37℃培养14h。选择白色菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒，经Hind Ⅲ和Xba I对质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送大连宝生物工程有限公司进行序列测定。

1.5.5 BAX中间片断的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 具体操作步骤同1.5.4。

2 RT-PCR的扩增结果

2.1 Bcl-2、Bax基因表达

对蒙古绵羊Bcl-2和Bax进行表达检测，根据对设计的引物，以脾组织的总RNA为模版，进行RT-PCR反应，将纯化产物直接送上海生工生物工程公司进行DNA序列测定，其中Bcl-2长160bp，Bax长134bp，经过网上NCBI BLAST序列比对，证明确实是Bcl-2(图1)和Bax(图2)基因表达。

图1 m.DL2000 DNA marker 1.Bcl-2 cDNA RT-PCR 产物的琼 脂糖凝胶电泳

图2 Bax cDNA RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

2.2 Bcl-2、Bax基因中间片断的克隆及重组质粒的筛选和鉴定

对RT-PCR 反应扩增产物与pmD18-T Vector 载体(2962bp)连接后获得阳性克隆，提取质粒DNA后用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ分别酶切鉴定，经0.8%琼脂糖凝胶电泳(90V，1.0h)检测，得到一个约160bp和134bp的片断，与预期的片段大小相符，证明已插入PmD18-T载体，并命名为重组载体PmD18-T- Bcl-2(见图3)和PmD18-T- Bax(见图4)。

图3 重组质粒PmD18-T- bcl-2 限制性酶切分析

图4 重组质粒PmD18-T-Bax 限制性酶切分析

2.3 bcl-2序列分析

通过RT-PCR扩增出160bp部分基因序列。TTCGCCG AGATGTCCCGTCAGCTGCACCGGAAAGCCGTTACGC GAGAGAGCTTCGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCA GGGACGGGGTGAACTGGGGGCGCATCGTGGCCTTCT TTGAGTTCGGAGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCA ACCGGGAGA。

2.4 Bax序列分析

通过RT-PCR扩增出134bp部分Bax基因序列。TCCGA GTGGCGGCTGAAATGTTTTCCGACGGCAACTTCAAC TGGGGCCGGGTTGTCGCCCTTTTCTACTTTGCCAGCA AACTGGTGCTCAAGGCCCTGTGCACCAAGGTGCCCG AGTTGATCAGGACCATCATG。

3 结论

Bcl-2是一个多基因家族，形成同源或异源二聚体，调控蛋白酶和核酸酶活性，双向调节细胞凋亡。其中促进凋亡的有Bcl-Xs、Bad、Bak、Bax等，抑制凋亡的有Bcl-2、Bcl-XL、Bcg-l等[3]。本研究通过RT-PCR技术，成功地扩增获得了绵羊Bcl-2 基因的cDNA 序列长度为160bp，得到的Bax基因序列长度为134bp，这与Oltavai Z.N所发现的Bax基因的外显子4相同。随着对Bcl-2基因序列的测定以及凋亡本身研究的日渐深入，有利于对研究该基因在各种动物上的分子调控机制。Bcl-2是作用机制和凋亡的分子机制最终被阐明，从而提高对与凋亡有关的疾病的认识和诊治水平。

[1]Korsmeyer S J.BCl-2 initiate a new category of oncogenes :r egulators of cell death.Blood , 1992 , 80 (4) : 879-886

[2]Brown R.British medical Bulletin, 1996；53:466-477

[3]Jimenez G S ,Khan SH ,Stommel J m ,et al.P53 regulation by post- translational modification and nuclear retention in response to diverse stresses[J].Oncogene ,1999 ,18 :76561