黄文明，沈明华

（1.青海省海南州同德县畜牧兽医工作站，青海 同德813200 ；2.青海大学畜牧兽医学院，青海 西宁 810016）

犬瘟热（Canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一种传染性极强的急性、病毒性传染病，宿主范围较广泛，能够使犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、金猫、猞猁等多种动物发生自然感染和发病。CDV在我国犬中的发病率和致死率都很高，宠物犬一旦感染后发病率可达100 %，死亡率也高达80 %，许多经济动物如水貂等一旦感染发病也会给养殖场带来严重的经济损失[1-2]。近年来国内不断有犬瘟热病毒感染发病的报道，应引起对该病毒的重视，加快相应新型疫苗与诊断试剂的研究。本研究对临床上1 例发病犬进行临床和实验室诊断，并分离到了病毒，最后确诊发病犬感染了犬瘟热病毒，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料 取临床发病的分泌物和排泄物进行相关诊断；犬瘟热抗原快速检测卡，购自深圳市康百得生物科技有限公司；一步法RT-PCR检测试剂盒、DL-2 000 DNAMarker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 临床症状 发病犬2 月龄，临床可见眼结膜潮红，分泌物多，有眼屎。精神沉郁，卧地不愿走动，发热，体温高达41.5 ℃，吃食减少，便血，未进行过犬瘟热疫苗的免疫接种，根据临床症状初步怀疑为犬瘟热病毒感染。

1.3 镜检 取病犬的分泌物和排泄物，涂片、染色、做美蓝和革兰染色电镜镜检。

1.4 试纸条检测 利用商品化的犬瘟热病毒检测试纸条进行检测。用干净的棉签蘸取病犬的分泌物和排泄物，放到专用稀释液中充分搅拌，用吸管吸取上清液，在试纸条样品孔正中滴加1滴吸液，10 min 后，观察结果。

1.5 RT-PCR 检测 根据参考文献[3]合成犬瘟热病毒检测引物，提取病犬的分泌物和排泄物的病毒基因组，按照参考文献[3]的RT-PCR 反应条件进行扩增，RT-PCR 扩增产物经核酸电泳观察结果。

1.6 病毒的分离培养 将1.4 中病犬的分泌物和排泄物稀释液用0.45 μm 的滤器过滤除菌作为病毒液，接种单层非洲绿猴肾细胞系（Vero）贴壁细胞，37 ℃作用1 h 后，加入含2 %新生牛血清的DMEM维持液培养基，置37 ℃培养箱中培养，每天观察细胞病变，当出现70 %～80 %细胞病变时收获病毒，盲传3 代，冻存备用。

1.7 分离毒株血凝价测定 96 孔V型板第一排的12 个孔中依次加入生理盐水25 μL，取第3 代分离毒株25 μL 加入第一孔，混合后取25 μL 加入第二孔，依次稀释到第11 个孔，即211稀释，第12 孔作为空白对照，取25 μL 1 %鸡红细胞加入上面孔中，37 ℃放置1 h，观察血凝试验结果。

1.8 分离毒株毒价测定 用96 孔微量细胞培养板测定细胞半数感染量（TCID50），将分离毒株做10-1～10-10倍梯度稀释，分别接种96 孔细胞培养板培养的Vero 细胞，每个稀释度接种8 个孔，0.1 mL/孔，置5 % CO2培养箱37 ℃培养7 d，逐日观察记录细胞病变情况，根据Reed-Munch 法计算TCID50。

1.9 分离毒株RT-PCR 检测 按照1.5 的方法对第3 代分离毒株进行RT-PCR 检测。

1.10 分离毒株的中和试验 将第3 代分离毒株与等量抗犬瘟热病毒特异性血清混合均匀后，置4 ℃中和反应过夜，次日接种单层Vero 贴壁细胞，观察细胞病变情况，同时设不接种和接种第3 代分离毒株分别作为阴性对照和阳性对照。

2 结果

2.1 镜检结果 病犬的分泌物和排泄物镜检未见任何致病菌。

2.2 试纸条检测结果 如图1 所示，试纸条检测线的位置出现清晰可见的条带，表明试纸条检测犬瘟热病毒阳性。

图1 试纸条检测结果

2.3 临床样品RT-PCR 检测结果 如图2 所示，RT-PCR 扩增产物经核酸电泳显示在242 bp 的位置具有特异性的扩增条带，与郭玲等[3]的报道相一致，RT-PCR 检测犬瘟热病毒阳性。

图2 R T-PCR 扩增结果

2.4 病毒的分离培养结果 如图3 所示，病毒液接种72 h 后开始出现细胞病变，细胞出现变小、圆缩，细胞颗粒增多，许多细胞融合聚集呈多核巨细胞，部分细胞坏死脱落，而未接毒的Vero 细胞无变化。

图3 正常Vero细胞和接毒病变细胞

2.5 分离毒株血凝试验（HA）结果 观察血凝试验结果可见血凝板的1～8 个孔出现肉眼可见的红细胞凝集，该病毒可以凝集1 %鸡红细胞，与犬瘟热病毒能与鸡、豚鼠等红细胞发生不规律的凝集反应特性相符。

2.6 分离毒株毒价测定结果 按Reed-Muench 法测定分离毒株的TCID50为10-4.25/0.1 mL。

2.7 分离毒株RT-PCR 检测结果 第3 代分离毒株RT-PCR 检测结果为阳性。

2.8 分离毒株中和试验结果 分离毒株与犬瘟热病毒阳性血清中和反应后接种的Vero 细胞未见任何细胞病变，表明分离毒株可被犬瘟热病毒阳性血清所特异性中和。

3 讨论

发生犬瘟热病毒感染后，应该尽早诊断并采取对症治疗措施，治疗原则是加强机体免疫力，同时采取抗菌消炎方法防止继发感染发生。故对疫病的准确诊断至关重要，随着CDV研究的深入，RTPCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP、ELISA、胶体金等各种技术不断应用到CDV的检测中，本研究根据自身试验条件分别选择了胶体金免疫学检测技术和RT-PCR分子生物学检测方法对临床诊断疑似CDV感染的病例进行了检测，经后续的病毒分离鉴定证实此次诊断结果准确、可靠。对CDV的分离培养，接种细胞的选择至关重要，魏风等[4]研究表明，CDV能在多种细胞上生长，但在Vero 细胞上病变最明显，毒价最高。故本研究选择Vero 细胞作为了CDV的分离培养细胞，取得了良好的试验结果，分离的毒株TCID50达10-4.25/0.1 mL，经细胞病变观察、血凝试验、中和试验、RT-PCR 鉴定分离株病毒为CDV。

随着我国特种经济动物养殖业和宠物业的不断发展，CDV的发病率一直居高不下，加强CDV诊断与流行病学方面研究工作，了解不同地区CDV的流行情况，对预防和控制犬瘟热病毒感染具有重要意义。该病的诊断就是要尽可能做到早诊断，早治疗，加大疾病治愈的几率。要控制和消灭CDV，应该加强该病毒的免疫接种，临床上好些病例都是由于未进行疫苗免疫接种导致，由于该病的传播迅速，易感动物种类繁多，给该病的综合防控提出很高要求。本试验分离鉴定了1 株CDV病毒，丰富了我国地方毒株资源，为疾病的相关诊断和防治提供参考，也为本实验室进行犬瘟热疫苗与诊断试剂的研究奠定了基础。

[1]李鑫，杨霞.菏泽市犬瘟热发病调查[J].黑龙江农业科学，2014（4）：68-70.

[2]吕九云，张彦龙.1 株貉源犬瘟热病毒的分离鉴定[J].中国兽医杂志，2013，49（6）：26-29.

[3]郭玲，万莉，马磊，等.犬瘟热病毒RT-PCR 检测方法的建立[J].中国兽医科学，2012，42（2）：60-64.

[4]魏凤，管宇，王金良，等.犬瘟热病毒在不同组织细胞上增殖特性的研究[J].动物医学进展，2010，31（2）：83-86.