王 光，孙艳朋，王利华

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

氮是构成微生物细胞蛋白和核酸的重要成分。微生物氮的来源可分为无机氮和有机氮，其中无机氮易溶解又有利于吸收；有机氮除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含有少量糖、脂肪、微量元素及维生素、生长素等营养物质[1]。江微等分别用等量的无机氮源和复合有机氮源代替原培养基中的尿素，结果表明，钉子菇对复合氮源利用最好，菌丝生长旺盛，浓密洁白，与无机氮源差异显著[2]。而朱永真等的研究表明，尿素为羊肚菌的最优氮源，其次是硝酸钾和硝酸钙，然后才是酵母膏等有机氮源[3]。

瘤胃真菌在反刍动物瘤胃中纤维物质分解消化过程中发挥重要的作用[4]。氮源影响真菌生长，而瘤胃真菌又可以产生纤维素酶，所以本试验研究酵母膏、菌糠、氯化铵、硫酸铵以及尿素作为真菌生长所需的氮源，以羧甲基纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性和发酵液pH 值的变化为指标，来探讨氮源对瘤胃真菌产纤维素酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株 本试验采用的瘤胃厌氧真菌取自装有永久性瘤胃瘘管的崂山奶山羊，用真菌培养基稀释10 倍，39 ℃培养3 d 后获瘤胃真菌产酶接种用菌株。

1.2 产酶培养基及试验设计 产酶培养基的配置参照朱崇淼[5]方法，发酵底物用花生蔓代替。

试验分6 个处理组，分别用相同质量的供试氮源（酵母膏、菌糠、氯化铵、硫酸铵、尿素）代替产酶培养基中的蛋白胨，以不加氮源为对照。

1.3 测定项目和方法 各处理组分别称取发酵底物花生蔓0.5 g，装入封口袋中，然后依次加入45 mL产酶培养基和5 mL 培养3 d 的真菌培养液，每个处理设3 个重复。完毕后挤净封口袋中空气并封口，放入39 ℃培养箱中培养，发酵时间分别为0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。在各时间点发酵结束，迅速从各封口袋中抽取适量发酵液上清，备测酶活性，酶活性测定方法参照朱崇淼[5]、王建等方法[6]。

在各个发酵时间点，用pH 计测定发酵液中的pH 值。

1.4 数据处理 试验数据均采用SAS软件中的Glm 过程对氮源、培养时间及二者的互作效应进行方差分析，并针对每种氮源的不同培养时间、每个培养时间点不同氮源进行方差分析，用Duncan 氏SSR 进行多重比较。检验误差为5%水平。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶活性测定结果 由表1 可知，不同氮源及培养时间对木聚糖酶活性影响显著，而且二者的互作显著（P＜0.001）。木聚糖酶活性达到最高点的时间大致在48 h 或是72 h，5 种氮源组的纤维素酶活性均显著高于对照组（P＜0.05），其中又以氯化铵组的酶活性为最高，显著高于其他试验组（P＜0.05）。24 h 时有机氮源组的木聚糖酶活性高于无机氮源组，48 h 后无机氮源组木聚糖酶活性迅速升高，并超过有机氮源组达到最高酶活性。培养72 h 氯化铵组、硫酸铵组、菌糠组及酵母膏组的酶活性均达到高峰，但氯化铵组的酶活性显著高于其他各氮源组（P＜0.05）。

2.2 羧甲基纤维素酶活性测定结果 表2结果表明，不同氮源及培养时间对羧甲基纤维素酶活性影响显著，而且二者的互作显著（P＜0.001）。48 h 时，硫酸铵组和酵母膏组酶的活性达到高峰，但与其他氮源组相比差异不显著（P＞0.05）。72 h 时，氯化铵组、菌糠组和尿素组酶活性达到最高，氯化铵组与尿素组的酶活性无显著差异（P＞0.05），但氯化铵组酶活性显著高于其他各时间点及各氮源组（P＜0.05）。

表1 不同氮源对木聚糖酶活性的影响

表2 不同氮源对羧甲基纤维素酶活性的影响

2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定结果 不同氮源及培养时间对β-葡萄糖苷酶活性影响显著，而且二者的互作显著（P＜0.001）。β-葡萄糖苷酶活性变化趋势与羧甲基纤维素酶大致相同（见表3），不同之处在于48 h 时，尿素组β-葡萄糖苷酶活性最高。72 h 时，氯化铵组的β-葡萄糖苷酶活性达到最高峰，与酵母膏差异不显著（P＞0.05），但显著高于其他各氮源组（P＜0.05）。

2.4 不同氮源组pH值变化结果 由图1 可知，各组pH 值随着时间增长逐渐下降，5 种氮源组120 h 的pH值下降值与对照组相比差异显著（P＜0.05），其中以菌糠组下降最快，相比0 h 时下降了0.86。酵母膏组和尿素组次之，二者之间差异不显著（P＞0.05）。氯化铵组和硫酸铵组pH 值差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 不同氮源对纤维素酶活性的影响 对照组的最高纤维素酶活性远远低于5 种氮源组，证明了氮源对厌氧真菌生长的重要性。本试验还发现瘤胃厌氧真菌对无机氮源的利用效果要优于有机氮源。Dijkerman 等报道，Piromyces E2 菌在以铵盐为氮源时生长最好，以谷氨酸、清蛋白、尿素等为氮源时，该菌的生长效果不好[7]。松乳菇对NH4+-N 和NO3--N 都能加以较好地利用，而其他外生菌和真菌利用NO3--N 的能力较差[8]。史宏志等研究表明，在中等施氮水平下，无机氮比例较大时有利于提高淀粉酶的活性[9]。但也有一些学者认为氨基酸类氮源比铵盐更有利于真菌生长，而且可以直接合成真菌所需的蛋白质[10]。白爱枝等认为以NaNO3为单一氮源时，72 h 木聚糖酶活力可达211.0 IU/mL，而且一般复合氮源对木聚糖酶产量的提高有利[11]。

表3 不同氮源对β-葡萄糖苷酶活性的影响

图1 不同氮源在不同培养时间对发酵液pH 值的影响

从本试验测得的酶活性大小看，远不如Wood等和Lee 等所报道的数据[12-13]。分析原因可能是与菌种差异及不同的发酵工艺有关，本试验所用发酵底物为粗纤维含量较高的花生蔓，没有添加玉米、麦麸等碳源。

3.2 不同氮源对发酵液pH 值变化的影响 体外培养时发酵液pH 值的变化受发酵底物，有机酸积聚以及氮源的影响。植物纤维素在消化道内被分解为纤维二糖，再由6-磷酸葡萄糖经过一系列过程生成丙酮酸，丙酮酸再生成丙酸及其他挥发性脂肪酸。厉学武等研究表明，在培养液中按培养底物秸秆添加2%筛选的瘤胃厌氧真菌可显著提高培养液中菌体蛋白和挥发性脂肪酸含量[14]。能量饲料发酵后会产生挥发性脂肪酸，蛋白饲料发酵后会产生一定量的NH3-N[15]。本试验表明，菌糠组pH 值下降最为明显，可能是菌糠相比其他氮源成分比较复杂（粗蛋白7.5%、粗脂肪7.2%、粗纤维45.16%、粗灰分11.3%、无氮浸出物38.19%），发酵时无氮浸出物可能被分解成有机酸，pH 值下降显著。

4 结论

添加不同氮源对瘤胃厌氧真菌产纤维素酶有一定的影响。从本试验的结果来看，以氯化铵做氮源可以产生较高活性的纤维素酶；不同氮源对发酵液pH 值也有影响，其中菌糠的影响最为明显。

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