姜艳平，吴 煜，张 希，姜新鹏，唐丽杰，乔薪瑗，崔 文，李一经

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

犬干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们具有广谱的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性[1-2]。犬干扰素其本身并不是一种抗病毒物质，它是通过诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白而发挥其抗病毒作用，或者干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前常用的抗病毒感染和抗肿瘤的生物制品。无论是天然的还是重组的犬干扰素均具有较强的抗病毒能力，临床上已经将重组的干扰素应用于防治狂犬病，犬细小病毒病，犬瘟热等病毒病中[3-4]。

干扰素具有不同的分类方法，目前常用的分类方法是按照主要功能分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω，Ⅱ型干扰素仅包括IFN-γ；其中γ干扰素基因全长为501 个核苷酸，编码166 个氨基酸，由23 个氨基酸的信号肽和143 个氨基酸的成熟蛋白组成[5-7]，IFN-γ是主要的免疫调节干扰素，IFN-γ可以增加细胞表面MHCⅡ类分子的表达，调节T 细胞、B细胞和NK 细胞之间的关系，增强免疫应答能力[8]。

本试验利用生物学软件对犬γ干扰素（CaIFNγ）基因进行优化，构建了可分泌表达CaIFN-γ蛋白的重组乳酸乳球菌表达系统，并通过MTT 法和实时定量PCR 方法对重组乳酸乳球菌表达的CaIFN-γ蛋白的抗病毒活性进行检测，这对CaIFN-γ在抗病毒活性以及免疫增强方面的作用进行深入研究奠定良好的物质基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 重组质粒pJLA605-CaIFN-γ由本实验室构建；乳酸乳球菌分泌表达型载体质粒pAMJ399、乳酸乳球菌PSM565（Lactococcus lactis PSM565），购自BIONEER 公司。

1.2 病毒、细胞及血清 犬肾细胞（MDCK）由本实验室保存，水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；兔抗CaIFN-γ血清由本实验室自制保存。

1.3 引物设计与基因合成 根据已发表的CaIFNγ基因序列[9]，并依据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性和表达载体的酶切位点，在不改变蛋白编码的基础上，将原有的CaIFN-γ序列由DNA2.0 公司重新优化设计并合成。利用Primer5.0 生物学软件，针对合成的CaIFN-γ基因序列设计引物P1、P2 用于重组载体的构建和鉴定。根据GenBank 上发表VSVN 基因的保守序列片段设计引物P3 和P4，用于SYBR Green real-time RT-PCR 试验扩增VSV病毒的N 片段；根据犬β actin 内参序列设计引物P5 和P6 用于犬肾细胞（MDCK）内参控制序列的扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 重组pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 的构建及表达 将优化后获得的CaIFN-γ基因与表达载体pAMJ399 进行连接，电转化到乳酸乳球菌PSM565中，筛选含有阳性重组质粒pAMJ399-CaIFN-γ的转化菌PSM565 进行培养。将重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/ PSM565 在32 ℃静置培养，通过自身产酸启动诱导，24 h 后离心，分别收集上清和沉淀，上清用TCA方法浓缩，沉淀用溶菌酶处理，以不含目的基因的pAMJ399/ PSM565 空载体组的上清和沉淀作为对照。然后以蛋白质标准分子量为参考，通过SDS-PAGE、Western-Blot 试验方法对诱导表达产物进行分析、鉴定。

1.5 重组乳酸乳球菌培养条件优化 为了获得重组蛋白表达的适宜pH 值和生长条件，将重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSMA565 按1∶100比例接种于含有不同量β-甘油磷酸二钠的GM17液体培养基中，即GM17 培养基中分别含有1%、1.5%、2%……3.5%β甘油磷酸二钠。32 ℃厌氧条件下静置诱导培养24h，每2 h 取菌液测OD600和pH 值，分析β-甘油磷酸二钠对重组乳酸乳球菌生长条件的影响。

1.6 犬γ干扰素抗病毒活性检测

1.6.1 细胞毒性试验 用0.25%胰酶将生长状态良好的单层MDCK 细胞进行消化，用完全培养基稀释成浓度约2×105/mL 个细胞的悬液，分装到24 孔板中进行培养，每孔加1 mL，待细胞长满单层后弃液，用无血清DMEM培养基2 倍倍比稀释重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 上清液，分别加入到24 孔板中，每孔100 μL，细胞对照和病毒对照孔加入同等体积的无血清培养液。37 ℃孵育72 h，每天观察并记录细胞状态。

1.6.2 MTT 法检测重组干扰素抗病毒活性 96 孔板长满单层的细胞上接种无血清DMEM培养基2 倍稀释的重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 的上清液，每孔100 μL，细胞对照和病毒对照孔加入无血清培养液。37 ℃孵育24 h，弃液，每孔加入100 μL 的VSV（约100 TCID50），细胞对照孔加入100 μL 无血清培养液。待病毒对照孔90%左右病变时，观察细胞各孔的病变结果。弃上清，每孔加入5 mg/mL 的MTT 染色液10 μL，37 ℃作用1 h，再加入DMSO100 μL，室温放置15 min，混匀，酶标仪OD470读值。

1.6.3 Real-Time PCR 测定病毒载量 将正常的细胞组，5 倍重组菌组pAMJ399-CaIF-γ/PSM565 和空载体组pAMJ399/PSM565 上清作用的细胞接种VSV后，孵育24～30 h，待正常细胞组病变完全后，将这3 组细胞的上清液收集。应用总RNA提取试剂盒提取细胞液中总RNA，通过反转录获得CDNA，-20 ℃保存备用。采用Real-Time PCR 方法检测各组细胞中VSV的载量，观察重组干扰素抗病毒效力。Real-Time PCR 方法中的Ct值由PCR 仪自动给出，ΔCt表示每个检测样本中的病毒载量，ΔCt=Ct目的基因—Ct参照基因。ΔCt值与病毒复制量呈反比，ΔCt值越低VSV感染量越高。

2 试验结果

2.1 重组乳酸乳球菌表达系统的构建 将筛选获得的阳性重组质粒pAMJ399-CaIFN-γ电转化到乳酸乳球菌PSM565 中，提取重组质粒进行鉴定；结果显示，单酶切目的片段与载体总大小约为7 400 bp，双酶切和PCR 检测插入片段长约440 bp（见图1），与预期结果相符。表明成功构建了pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 表达系统。

图1 重组质粒pAMJ399-Ca IFN-γ酶切和PCR 鉴定结果

图2 重组乳酸乳球菌蛋白表达SDS-PAG E 结果

2.2 CaIFN-γ在重组乳酸乳球菌中的表达及鉴定重组菌上清和沉淀经SDS-PAGE 分析结果显示（见图2），重组乳酸乳球菌的菌体沉淀中有一条约20 ku 大小的蛋白条带，与预期目的蛋白大小相符；重组菌上清和沉淀经Western-Blot 分析结果显示（见图3），上清和菌体沉淀中均有约20 ku 的特异条带出现，与预期大小相符，说明重组菌能够诱导表达出目的蛋白，并在菌体和上清中均有表达，但在上清中蛋白含量较低，需进一步优化。

图3 重组蛋白Western-Blot鉴定结果

2.3 重组犬γ干扰素抗病毒活性的检测

2.3.1 重组犬γ干扰素细胞毒性试验 将浓缩5倍、10 倍的含有重组CaIFN-γ蛋白的菌体上清液加入到培养单层的MDCK 细胞中，观察重组CaIFN-γ对细胞的毒性作用。结果显示，正常组细胞呈多角形紧密排列贴壁生长，大小均一；10倍浓缩的空载体组和重组菌组上清作用的细胞大小不一，细胞之间比较疏松，有的没有典型的多边形形态，部分细胞之间有细胞脱落的空隙存在；而5 倍浓缩的上清作用的细胞形态好于10 倍浓缩，基本与正常细胞的镜下结果相似，因此采用5 倍及以下浓缩的上清进行下一步试验。

2.3.2 干扰素抗病毒活性 原倍和5 倍浓缩的重组菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 上清液作用于铺满单层的MDCK 细胞后，接种VSV，观察细胞病变情况。结果显示，与正常细胞相比，重组菌组和空载体组的原倍上清作用后的细胞接种病毒后与病变组细胞差别不大，保护作用不明显，细胞圆缩，脱落；5 倍浓缩的上清作用的细胞接种病毒后，细胞的形态与正常细胞组形态相似，保持四边形或者多边形结构紧密排列，表明对细胞具有保护作用。

2.3.3 MTT 法检测重组干扰素抗病毒活性结果利用MTT 法检测活细胞的数量，从而分析病毒的繁殖情况。由统计分析结果可知（图4 所示），5倍浓缩上清的IFN 组相比病毒组差异极显著（P＜0.01），能够抑制病毒的生长繁殖。

图4 MTT 法检测浓缩后干扰素上清的抗病毒活性

2.3.4 荧光定量PCR 检测MDCK 细胞攻毒后的病毒载量 应用SYBR Green 实时定量PCR 方法测定重组干扰素作用的MDCK细胞接种病毒后的病毒感染量。由结果可知（图5），重组菌组pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 与空载体组pAMJ399/PSM565 和病毒组的ΔCt值差异极显著（P＜0.01）。说明重组菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 分泌上清5 倍浓缩作用的MDCK细胞攻毒后的病毒载量明显低于病毒对照组，γ干扰素起到了明显的抗病毒作用。

图5 SY BR G reen real-timeR T-PCR 检测MDCK 细胞未孵育干扰素和孵育干扰素后VSV感染程度的比较

3 讨论

20 世纪80 年代初，人的干扰素基因克隆成功后，各国学者相继开展了犬干扰素的研究。其产品可应用于临床的治疗或作为免疫佐剂配合疫苗的使用来提高抗体对抗原的免疫应答水平[10]。但动物γ干扰素的研究起步比较晚，各项技术还不成熟，存在着很多问题，首先，重组表达的CaIFN-γ多以包涵体形式存在，利用率较低，其次，CaIFN-γ在不同的表达系统和测定系统上活性不同，因此有待深入研究，逐步优化干扰素的使用方法和条件。

目前常用获得重组蛋白的表达方法主要有真核表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统和乳酸菌表达系统，真核表达系统获得的重组蛋白活性好，但产量低，在实际应用中比较困难；大肠杆菌表达的重组蛋白经常是以包涵体形式存在，不利于重组干扰素的临床应用；乳酸菌表达系统中的乳酸乳球菌，作为表达和传递外源基因的载体系统具有益生性、安全性，以及可通过先天性免疫激活肠道黏膜免疫系统，不会刺激机体产生抗体等重要特点，尤其是分泌型载体表达的外源蛋白无需纯化，直接可以应用到生产实践中，近年来受到越来越多的重视。

本研究构建重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565，获得了分泌表达的犬γ干扰素蛋白，将培养pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565 的培养上清液进行5 倍浓缩后与MDCK 细胞进行作用24 h后，接种VSV病毒，通过观察病变、MTT 法检测活细胞数及荧光定量PCR 检测方法，均证实该蛋白能够抑制VSV的复制，具有明显的抗病毒活性。为进一步研究犬γ干扰素在临床上的抗病毒应用和作为细胞因子佐剂的研究奠定了物质基础。

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