夏彦玲 桂姗姗 喻月婷 敖艳霖 曲昊淼

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

鹿茸不同生长期MALAT1基因的差异表达1)

夏彦玲 桂姗姗 喻月婷 敖艳霖 曲昊淼

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

以不同生长期的鹿茸尖端组织为材料，采用mRNA差异显示技术检测不同生长期鹿茸尖端间充质组织的差异表达基因。对其中一条差异表达片段进行克隆测序分析，得到400 bp左右的片段，与野猪的非编码基因MALAT1有高度同源性，同源性为90%。进一步实时荧光定量RT-PCR鉴定发现，该基因在鹿茸生长发育的前期和中期表达量高于后期，该基因在鹿茸快速生长期的上调表达暗示其在鹿茸生长发育过程中发挥作用，是鹿茸生长发育相关基因的候选基因。

鹿茸；mRNA差异显示；差异表达基因；MALAT1；实时荧光定量RT-PCR

We screened the specially expressed cDNA fragments of mesenchymal layer in different stages by mRNA differential display polymerase chain reaction (DD-PCR). We chose a band displayed significantly differential expression to clone, check and analyze. The fragment (400 bp) had highly homology to Metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1) with the homology of 90% to Sus scrofa’sMALAT1. By real time RT-PCR, the expression level ofMALAT1 gene in early and middle stages was higher than the expression level in late stage. The special up-regulation ofMALAT1 gene in rapid growth period implied it might be an important factor in the process of growth and development of antler.

肺腺癌转移相关转录本(MALAT1)全长8.7 kb，缺乏有意义的开放式阅读框，该基因高度进化保守，部分区域存在种属间序列高度同源的特点。MALAT1属于核内保留RNA，主要通过与细胞核内多种蛋白质相互作用，在转录水平和转录后水平参与基因的表达调控。该基因虽然不直接编码蛋白，但对多种肿瘤的增殖、凋亡、侵袭转移、耐药都有不同程度的影响[1-3]。

鹿茸是鹿科雄性动物的第二性征，是唯一可以进行再生的组织器官，鹿茸组织在快速生长期增殖分化非常迅速，鹿茸生长速度最快可达每天2 cm，超过任何哺乳动物骨组织的生长速度。高光志[4]对梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸的生长发育过程进行研究，发现鹿茸生长过程分为生长期和骨化期。生长期生长占优势，骨化缓慢。骨化期内，鹿茸迅速骨化，沉积大量矿物质，阻碍鹿茸的生长，所以，鹿茸的生长速度快速下降。据此可以推断其所表现的各种独特性状必定来源于基因表达的差异。

鹿茸尖端组织是茸角的生长分化中心，鹿茸的快速生长主要取决于尖端组织生长中心细胞的分裂增值速度，生长中心细胞主要分布在增殖区，即间充质、前软骨和软骨区，间充质组织是未分化的细胞。本研究以不同生长期的鹿茸尖端间充质组织为材料，通过DD-PCR检测出一条400 bp左右的差异表达片段，对其进行克隆测序分析，通过real-time RT-PCR验证该基因在鹿茸不同生长期的表达差异，进一步研究其在鹿茸生长发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

选取人工驯养的一头健康成年东北梅花鹿作为试验动物。小鞍子茸期型时采集左茸顶端组织作为前期试验样品，二杠茸型时采集右茸顶端组织作为中期试验样品，被锯的左茸再长至三杈茸型时采集其顶端组织作为后期试验样品，分别截取3个时期的鹿茸顶端5 cm左右，表面迅速消毒，纵向剖开，按照Li等[5]所述的方法采取鹿茸顶端的间充质组织，按每管大约100 mg分装于冻存管中，迅速放入液氮罐中保存，备用。

1.2 方法

差异显示PCR：按照Trizol试剂的操作步骤分别提取不同生长期鹿茸间充质组织的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光法检测总RNA质量。以提取的总RNA为模板，以锚定引物为反转录引物，以M-MLVⅢ逆转录酶反转录合成cDNA。差异显示PCR反应体系为25.00 μL，2.50 μL 10×PCR缓冲液，2.50 μL dNTP(2.5 mmol)，2.00 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，4.00 μL锚定引物M(10 mmol·L-1)，0.80 μL随机引物S(10 mmol·L-1)，0.125 μL rTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)，3.00 μL cDNA，用超纯水补足25.00 μL。在PCR仪上，94 ℃预变性，5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min(40个循环)；最后72 ℃延伸10 min。引物序列见表1。

表1 引物序列

银染、差异显示条带的回收及再扩增：差异显示PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后切下差异表达条带，并用煮沸法回收。以回收产物为模板进行二次PCR扩增，反应体系及条件同差异显示PCR。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以鉴定二次扩增的产物是否与回收片段一致。

克隆及序列分析：按照DNA胶回收试剂盒使用说明，将二次扩增PCR产物进行纯化回收，并与pMD18-T载体连接后转入感受态细胞。挑选白色单菌落进行PCR鉴定，含阳性重组质粒的菌液送于华大公司测序。

MALAT1实时荧光定量RT-PCR分析：分别以不同生长期鹿茸间充质组织的总RNA为模板，以Oligo-dT为引物，以M-MLVⅢ逆转录酶反转录合成cDNA。根据GenBank上发表的野猪等物种MALAT1基因序列合成同源性引物(表1)，对鹿茸不同生长时期的MALAT1基因表达量进行定量分析。PCR反应体系(25 μL)包括，SYBR Premix EXTaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL，cDNA模板1.0 μL，上游及下游引物(10 mmol·L-1)各1.5 μL，加高压灭菌水补足体积至25 μL。反应程序，95 ℃ 30 s，在95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环40次，通过2-ΔΔCt法来计算分析基因在不同时期的相对表达量。每个样品3个重复，Ct值取平均值；计算目的基因的平均Ct值与内参基因的平均Ct值的差ΔCt；通过每个样品的ΔCt值减去对照样品的ΔCt来确定ΔΔCt值。

2 结果与分析

2.1 鹿茸生长发育差异表达基因的筛选

3个不同时期的间充质总RNA经琼脂糖凝胶检测后，清晰可见28 S、18 S和5 S条带(图1)，OD260/280比值为1.8～2.0。检测结果表明，所提RNA完整性较好，纯度较高，符合DDRT-PCR对模板的要求。

M 后期 中期 前期

图1 不同生长期鹿茸间充质组织的总RNA电泳

将3个不同时期的鹿茸间充质RNA经反转录后，以cDNA为模板利用锚定引物和随机引物3对物组合进行DDRT-PCR扩增，PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及显色后即可进行差异表达片段的筛选(图2)，选取其中的一条差异条带经二次PCR后(图3)，进行PCR产物的回收、纯化及克隆。

后 中 前 M

图2 差异表达片段聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2 差异表达基因的克隆及序列比对

选取一条中期表达量最高的差异条带，经二次PCR扩增成功后，将该片段纯化连接到pMD18-T载体后转入感受态细胞，37 ℃培养过夜后挑取白色单菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定结果与预期相符，且条带单一，证明所挑取的单菌落为阳性克隆，送交华大公司测序。片段大小在400 bp左右，它在鹿茸生长中期表达量最高，前期至中期表达上调，中期至后期表达下调。登陆到NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，用BLAST软件对测出的差异条带序列与GenBank中的EST库中已有的序列进行比对。结果显示，该差显基因与野猪的MALAT1基因高度同源，同源性为90%。

M 差异条带

图3 差异片段的二次扩增

2.3 MALAT1基因的real time RT-PCR分析

经熔解曲线分析，β-actin和MALAT1基因分别在89 ℃和81.5 ℃出现单一产物峰。表明引物特异性良好，无非特异性产物及引物二聚体等生成(图4)。

图4 MALAT1、β-actin溶解曲线

实时荧光定量RT-PCR的结果显示，MALAT1基因在鹿茸生长前期和中期表达量显著高于后期，中期表达量最高(表2)。

表2 鹿茸间充质组织不同生长期MALAT1基因表达水平的检测结果

生长期β-actin平均CT值MALAT1平均CT值ΔCTΔΔCT12-ΔΔct1前期17.95±0.3220.14±0.032.20±0.3401中期17.99±0.1019.72±0.231.73±0.32-(0.47±0.21)1.39±0.20后期17.25±0.4321.79±0.104.54±0.462.34±0.640.21±0.08

3 结论与讨论

利用3对引物进行DD-PCR筛选鹿茸生长发育相关功能基因，共发现7条差异条带，每对引物3个重复，选取重现性高，二次PCR扩增正确的一条差异条带进行回收克隆测序，降低了假阳性，增加了差异表达条带的可靠性，利用NCBI上的BLAST软件进行比对，确定该基因为长链非编码基因——MALAT1基因。

MALAT1虽然不编码蛋白质，但却广泛参与机体生理和病理的过程。MALAT1广泛表达于哺乳动物正常组织，并在人类多种肿瘤组织中高表达。研究显示，MALAT1在骨髓、脑、软骨、胚胎干细胞、食管、胆囊、卵巢、肌肉等组织恶性肿瘤中的表达均不同程度上调[6]。Garen等[7]指出MALAT1过度表达可下调肿瘤抑制因子PSF，共同参与肿瘤发生。也有研究发现下调MALAT1能有效抑制直肠癌细胞转移[8]。Guo等[9]发现在宫颈癌细胞株中，沉默MALAT1会导致Bcl-2、Bcl-xL下调、Bax上调，从而促进细胞凋亡。Bernard等[1]在对心肌、脑、肾、脾脏等细胞进行RNA原位荧光杂交后发现，MALAT1在上述细胞的核内定位，均集中在核小斑结构。核小斑是储存、加工mRNA前体剪接因子的重要场所，可招募、储存、修饰、组装信使RNA前体加工因子[10]，这说明MALAT1在mRNA前体的加工过程中可能发挥重要作用。

鹿茸生长发育分为生长期和骨化期，生长期以生长为主，骨化缓慢，骨化期生长速度下降，骨化增强。本试验通过实时荧光定量RT-PCR发现MALAT1基因的表达量前期至中期表达上调，中期至后期表达下调，中期(快速生长期)MALAT1基因的表达量最高，该基因在生长期表达量显著高于骨化期，提示该基因可能是促使鹿茸快速生长的候选基因之一，其发挥作用的机制可能与MALAT1参与鹿茸发育相关功能基因的转录水平和转录后水平的表达调控有关，也可能通过调控鹿茸间充质细胞凋亡通路中的Bcl-2和Bcl-XL来影响细胞的凋亡实现。

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MALAT1 Gene Differential Expression of the Antler Tissue in Different Stages

Xia Yanling, Gui Shanshan, Yu Yueting, Ao Yanlin, Qu Haomiao(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：104-106.

Antler; mRNA differential display; Differential expression gene;MALAT1; Real time RT-PCR

1)中国博士后基金项目(20110491124)；东北林业大学大学生创新项目(201310225110)。

夏彦玲，1974年10月生，东北林业大学野生动物资源学院，副教授；黑龙江省农业科学院博士后科研工作站,博士后。E-mail：xiayanling1974@163.com。

2014年9月24日。

S825.2

责任编辑：程 红。