孔维信,邓振兴，张林，孙怀鑫，丁露露(上海交通大学医学院苏州九龙医院，江苏苏州50；山东省医学科学院附属医院)

·基础研究·

小鼠足细胞Tbxa2r基因敲低方法探讨

孔维信1,邓振兴2，张林1，孙怀鑫1，丁露露1(1上海交通大学医学院苏州九龙医院，江苏苏州21502；2山东省医学科学院附属医院)

摘要：目的设计并筛选对足细胞血栓素A2受体(Tbxa2r)基因表达敲低效果最佳的siRNA序列。方法培养永生性小鼠足细胞(MPC5)，取生长占培养板70%细胞用于实验。设计4条siRNA序列(Tbxa2r-mus-1150、Tbxa2r-mus-1309、Tbxa2r-mus-1677、Tbxa2r-mus-1884)，经转染效率验证后转染足细胞。将细胞分为四组：干扰组(以筛选出的干扰序列转染细胞)、空白组(正常细胞样品)、模拟组(只加转染试剂的细胞样品)、阴性对照组(转染无序干扰系列的细胞样品)。Real-time PCR检测各组细胞Tbxa2r基因，Western blot法检测Tbxa2r蛋白。结果筛选出干扰效果最强的siRNA序列Tbxa2r-mus-1677，其转染24 h后对Tbxa2r基因表达干扰效果较小，而在转染48 h后足细胞Tbxa2r基因相对表达量最低。转染72 h后，细胞Tbxa2r蛋白相对表达量明显降低。结论采用Tbxa2r特异性siRNA技术成功敲低足细胞Tbxa2r基因表达，并筛选出敲低效果最佳的siRNA序列。

关键词：足细胞；血栓素A2受体基因；小分子RNA干扰技术；基因敲低

血栓素A2(TXA2)是花生四烯酸代谢过程中生成的产物。TXA2及血栓素受体激活参与血管紧张素Ⅱ依赖性高血压、糖尿病肾病的发生发展[1]。有研究表明，血栓素合成酶抑制剂或血栓素受体拮抗剂对链脲佐菌素诱导的肾损伤、狼疮性肾炎、环孢素肾毒性、残余肾及肾移植物排异反应均有疗效，但作用机制尚不明确[2]。2011年7月～2012年12月，我们设计了不同小干扰RNA(siRNA)序列，将小鼠足细胞TXA2受体(Tbxa2r)基因敲除或敲低，并对siRNA序列进行筛选，为进一步研究血栓素合成酶抑制剂或血栓素受体拮抗剂的作用机制奠定理论基础。

1材料与方法

1.1主要试剂RPMI1640培养基、10%胎牛血清、Trizol、重组干扰素-γ(IFN-γ)购自美国Sigma公司；反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、转染试剂Metafectene购自德国Biontex公司；兔抗小鼠Tbxa2r多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、TRITC标记的羊抗兔IgG购自美国KPL公司；小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗小鼠IgG购自上海华美生物工程公司。

1.2小鼠足细胞培养条件永生性小鼠足细胞(MPC5)由Peter Mundel教授(美国Mount Sinia医学院)馈赠。培养条件参照文献[3]。取生长占培养板70%的细胞用于实验。

1.3siRNA序列设计目标基因Tbxa2r基因序列从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3′端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶点。根据相关研究结果[4]，用Genepharma Desiger 2.0软件辅助设计4条GC含量在30%～50%的siRNA序列，见表1。

表1　潜在靶点的siRNA序列设计

1.4细胞转染与分组由于无法判断足细胞是否能进行脂质体转染，在实验前先进行转染效率评价：将荧光素Fam标记的siRNA以一定比例与阳离子脂质体Lipo2000分别按10 pmol/0.25 μL、10 pmol/0.5 μL、20 pmol/0.5 μL混合，混合物按脂质体转染说明书进行实验，通过荧光显微镜观察siRNA进入细胞的数量及细胞生长状态。选择最合适的siRNA与脂质体混合比例，参照文献[5]。将细胞分为四组：干扰组(以筛选出的干扰序列转染细胞)、空白组(正常细胞样品)、模拟组(只加转染试剂的细胞样品)、阴性对照组(转染无序干扰系列的细胞样品)。

1.5Tbxa2r基因及蛋白检测

1.5.1Tbxa2r基因检测Trizol试剂盒提取细胞总RNA，计算RNA浓度。琼脂糖电泳检查RNA的完整性。分别于转染后24、48 h采用Real-time PCR法检测Tbxa2r基因表达。以GAPDH和PPIA为内参。Tbxa2r mRNA上游引物序列为5′-GACTAAGGACGGAGCTACGACA-3′，下游引物序列为5′-TGAGCCTGGAGGAATGTGAA-3′，反应产物249 bp；GAPDH基因上游引物序列为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列为5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，反应产物123 bp。PPIA上游引物序列为5′-CAAATGCTGGACCAAACACAA-3′，下游引物序列为5′-GCCATCCAGCCATTCAGTCT-3′，反应产物71 bp。PCR反应体系：2× RT-PCR混合物10 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，cDNA模板2 μL，5 U/μL r Taq DNA聚合酶 0.4 μL，双蒸水定容至20 μL。反应条件：95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，共40个循环。溶解曲线检测PCR引物的特异性，绘制荧光定量曲线。荧光曲线的起峰位置(即Ct值)初步判断核酸浓度，核酸浓度越高，起峰位置越早，Ct值越低。利用模板Ct值与该模板的起始拷贝数呈对数线性关系，计算目标基因与内参基因的相对含量。

1.5.2Tbxa2r蛋白检测分别于转染后48、72 h采用Western blot法检测Tbxa2r蛋白相对表达量，操作步骤参照文献[5, 6]。

2结果

2.1细胞转染情况荧光显微镜观察结果显示，当用0.5 μL Lipo2000与10 pmol siRNA、0.5 μL Lipo2000与20 pmol siRNA转染细胞时，足细胞出现皱缩或脱落，对细胞生长影响较大；而0.25 μL Lipo2000与10 pmol siRNA的转染效率为70%，此时细胞状态和正常足细胞基本一致，故选择该比例进行转染。

2.2Tbxa2r基因表达Tbxa2r引物扩增产物溶解温度为86～88 ℃，PPIA引物扩增产物为82～86 ℃，GAPDH引物扩增产物为86～88 ℃，证明所用PCR引物特异性良好，扩增的产物为目标基因。由荧光定量曲线可知，样品中Tbxa2r基因含量极低，荧光曲线起峰位置在32个PCR循环左右，而内参基因PPIA和GAPDH的起峰位置均在16个循环左右。各干扰序列在转染后24 h对目标基因表达几乎没有干扰效果。而在转染后48 h时，第3条和第4条干扰序列转染的细胞荧光曲线起峰位置向后推迟了两个循环(说明存在一定干扰效果)。经计算，引物Tbxa2r-mus-1677干扰48 h后Tbxa2r基因相对表达量最低，为0.18，初步判定这条干扰序列作用效果最好。干扰系列对内参基因的含量影响不大。见表2。

表2　各组细胞Tbxa2r基因相对表达量

2.3Tbxa2r蛋白表达转染后48 h，Tbxa2r蛋白表达丰度不高，但可以看出条带，而在转染后72 h，Tbxa2r蛋白表达量明显降低。各组Tbxa2r蛋白相对表达量结果见表3。Real-time PCR结果与Western blot结果共同表明，Tbxa2r-mus-1677在转染48 h时从mRNA水平下调足细胞Tbxa2r表达，在转染72 h时，从蛋白水平下调Tbxa2r表达。

表3　各组细胞Tbxa2r蛋白相对表达量

3讨论

RNA干扰技术是通过siRNA造成目的mRNA特异性降解，从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界，是生物进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制，为稳定基因组发挥重要作用。RNA干扰是一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具，广泛用于功能基因组学研究领域。研究表明，环氧合酶-2(COX-2)的表达与足细胞凋亡相关。Cheng等[7]认为足细胞COX-2过度表达可使细胞更易受到损伤。我们前期研究发现嘌呤霉素氨基核苷(PAN)可诱导足细胞凋亡，COX-2表达增加；进一步将足细胞COX-2基因敲除或敲低，发现经PAN诱导发生的足细胞凋亡较未敲低者明显减轻[8～10]。COX-2基因敲低、表达减少或COX-2活性抑制，可导致下游的一种前列腺素物质即TXA2产生减少[11～18]，使后者对足细胞的损伤减轻。TXA2通过与其受体Tbxa2r结合发挥作用。Tbxa2r广泛分布于不同组织器官的细胞膜及细胞内结构上，由7个跨膜区、3个细胞外袢和3个细胞内袢组成。Tbxa2r与TXA2结合后，可引起与受体偶联的G蛋白发生变构，激活细胞内信号转导系统，调节细胞代谢，引起血小板聚集和血管平滑肌收缩，进一步参与血管紧张素Ⅱ依赖性高血压、糖尿病肾病的发生发展[1]。

本课题组在前期实验的基础上进行了Tbxa2r siRNA实验，将足细胞Tbxa2r基因敲除或敲低。由于TXA2有很强的生理活性，如将Tbxa2r基因敲除则可能干扰足细胞的正常功能，因此我们选择足细胞Tbxa2r基因敲低，维持其基础的基因表达。我们采用siRNA技术，首先根据转染效率筛选出最合适的脂质体与siRNA反应比例(0.25 μL Lipo2000与10 pmol siRNA)，照此比例将合成的4条siRNA转染小鼠足细胞。PCR荧光定量曲线结果显示，第三条siRNA序列(Tbxa2r-mus-1677)在转染后48 h对Tbxa2r基因的敲低效果最好。将此干扰序列转染细胞，得到实验所需的干扰组，再与空白组(正常细胞样品)、模拟组(只加转染试剂的细胞样品)、阴性对照组(转染无序干扰系列的细胞样品)比较发现，Tbxa2r-mus-1677干扰48 h后Tbxa2r基因相对表达量最低(为0.18)；转染48、72 h后，Tbxa2r蛋白表达丰度不高，而在转染后72 h表达明显降低。以上结果表明，Tbxa2r-mus-1677相应的siRNA序列对小鼠足细胞中的Tbxa2r有最好的敲低效果，其在转染后48 h时下调Tbxa2r基因表达，转染后72 h下调Tbxa2r蛋白表达。

本研究采用Tbxa2r特异性siRNA技术，成功敲低小鼠足细胞中Tbxa2r基因表达，并筛选出敲低效果最强的siRNA序列，为特异性Tbxa2r拮抗剂干预足细胞凋亡相关的实验研究奠定了基础。

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(收稿日期：2014-07-22)

通信作者：邓振兴

基金项目：苏州市科技计划项目(SYSD2011070)。

中图分类号：R329.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0024-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.008