郝文丽，陈志宝，赵　蕊，薄　乐，张腾龙

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院， 黑龙江 大庆 163319)

复合因素建立亚健康小鼠模型

郝文丽，陈志宝，赵蕊*，薄乐，张腾龙

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院， 黑龙江 大庆 163319)

摘要：目的:复合因素建立与临床症状相似的亚健康小鼠模型。方法:采用强迫游泳、睡眠剥夺、装管束缚、夹鼠尾应激建立亚健康小鼠模型，通过小鼠外观、行为学数据及病理检测鉴定模型是否成功。结果:造模结束后，模型组小鼠外观、体重、自主活动量、避暗次数、绝望时间、力竭游泳时间与对照组小鼠相比差异显著(P<0.05)，病理结果显示模型组小鼠未见异常。结论:复合因素成功建立亚健康小鼠模型。

关键词：复合因素; 亚健康模型; 小鼠

随着社会的发展，人们生活环境的改变以及社会竞争的日趋激烈，很多人日渐出现疲劳、失眠、虚弱、健忘、抑郁、易怒、易紧张等症状，且检查机体未有患病症状，这种健康与疾病之间的状态被称为亚健康状态(sub-health)，人们习惯将其称为第三状态或灰色状态[1-3]。亚健康属未病范畴且是未病之一，已成为危害人类健康的重大隐患之一，以疲劳、活力减退、免疫力降低、记忆力下降为主要的临床表现。亚健康问题受到了国内外学者们的高度关注，然而却未见统一的亚健康模型的建立标准。常见单一因素即应激刺激、强迫游泳、限制运动等建模方法，未能全面考虑亚健康多由于躯体、心理、社会竞争等共同因素作用而形成的。本实验综合考虑亚健康的主要成因及临床表现，既往研究单一因素[4-8]及少数复合因素[9,10]建模的基础上，加以改进，采用强迫游泳、睡眠剥夺、束缚、夹鼠尾应激来建立模型，通过小鼠的表观现象、行为学数据以及肝脏、肾、胸腺、脾的病理观察，来验证是否成功建立亚健康模型。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级健康昆明小鼠，雄性，4周龄，18-22 g，购于长春医科大学实验动物中心。

1.2主要仪器

S 多功能小鼠自主活动分析仪、避暗穿梭仪

1.3亚健康模型的建立

雄性昆明小鼠(50只)饲养适应一周后，随机分2组，使得两组鼠的体重平均值基本相同。对照组(10只)正常无菌饲养，建模组(40只)用于建立亚健康模型。所有小鼠饲养用品及实验用品都定期进行灭菌消毒。

1.3.1游泳建模

制作直径为100 cm的游泳池，水深30 cm，水温25 ℃左右，温度过高小鼠易晕厥，温度过冷，小鼠易抽筋溺水。每天8∶00将小鼠放入水中，强迫游泳50 min，14∶00强迫游泳50 min，其余时间睡眠剥夺，直至每天20∶00结束。游泳过程中动物如体力不支沉入水中，及时捞出，防止溺死。

1.3.2睡眠剥夺建模

在游泳池中放置l个直径为55 cm、高31 cm的圆圈铁丝网平台(平台面距水面约1. 0 cm)，供小鼠休息，若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中。

1.3.3束缚建模

第三周开始装管束缚(50 mL离心管穿孔)，保持空气通畅，小鼠禁食不禁水。每天22∶00装管，次日6∶00放出，共7 d。

1.3.4应激建模

第四周开始每天20∶00将动物从平台上取下，吹干处理后放入饲养笼中自由进食饮水，防止动物因受潮受凉而患病。用尖端缠有纱布的止血钳夹小鼠尾部，夹尾已不破皮不流血不断尾为度，建模过程中保证每只鼠夹尾次数一致，随机更换小鼠夹尾。每次刺激1 h。22∶00时去除止血钳，全天造模结束。

建模28 d结束后观察小鼠精神状态、皮毛、排便；称量建模28 d后对照组小鼠和模型组小鼠的体重，分析体重的整体差异。用多功能小鼠自主活动仪记录小鼠5 min内活动次数来评价小鼠自主活动的能力；避暗穿梭测试仪记录小鼠5 min内避暗穿梭次数来评价小鼠的记忆能力；有机玻璃穿孔使鼠尾悬挂小鼠挣扎，记录5 min内小鼠因绝望而累计不动的时间，评价绝望程度。水温20 ℃，小鼠尾系其体重百分之十的铁块进行力竭游泳时间记录，已鼻尖沉入水下10 s为停止记录时间，评价小鼠疲劳程度。

1.4 He染色

将小鼠颈椎脱臼处死，立即解剖进行大体检查，取小鼠肝、肾、胸腺、脾，摘除好各器官周围组织，全部标本经10%福尔马林固定，低温修剪组织，在80 %、90 %、95 %、100 %各种浓度乙醇2 h进行脱水处理，浸蜡、石蜡包埋，连续切片机切成厚度约5 μm的组织切片，苏木精-伊红(HE)染色，干燥，制成HE染色切片，光学显微镜下观察，照相。

1.5统计学分析

2结果

2.1亚健康模型一般状况

表观上模型组烦躁、易怒、撕咬、皮毛欠光泽、排便稀；对照组行为表现无异常。建模结束后，将建模鼠40只，剔除病鼠，剩余鼠中随机抽取30只做亚健康建模评价的数据统计。

分组n体重(g)自主活动次数5min(x)避暗穿梭次数5min(x)5min内累计不动(s)力竭时间(s)对照组1027.41±1.27213.30±31.41.7±1.5161.00±56.96650.60±198.74模型组1021.20±2.53**111.40±30.2*8.8±2.52**178.40±88.34**254.20±144.28**

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

从表1看出28 d建模后，模型组小鼠体重低于对照组，即复合因素造模影响动物的生长发育和新陈代谢，与亚健康者体重下降表现相似；模型组小鼠5 min内自主活动量小于对照组，且表现出精神倦怠，疲劳；模型组小鼠5 min内避暗穿梭次数高于对照组，即记忆力明显低于对照组小鼠，符合亚健康状态记忆力降低的情况；绝望测试结果显示模型组小鼠5 min内呈现间歇性挣扎，挣扎时间明显小于对照组；力竭游泳时间测试结果显示模型组小鼠先沉于水下，体力明显不如对照组小鼠。以上结果均符合亚健康基本特性。

2.2病理学分析

图1　肝脏、肾、胸腺、脾HE染色(HE×20x)Fig.1　Mice liver、kidney、thymus、spleen HE staining(HE×20x)注：A为空白对照组，B为亚健康组。

肝、肾、胸腺和脾脏的病理结果显示，复合因素建立的亚健康模型未对小鼠各脏器造成器质性病变。

3讨论

疲劳、活力减退、记忆力降低等为亚健康的主要临床表现，多由于躯体压力、社会压力、心理压力等多方面因素共同刺激形成[11]，严重威胁人类的生活。本实验采用强迫游泳、睡眠剥夺、束缚、夹鼠尾应激复合因素制造的亚健康小鼠模型，通过对其体重变化、自主活动量、避暗穿梭次数、鼠尾悬挂5 min内累计不动时间、负重游泳力竭时间的统计验证以及肝、肾、胸腺、脾脏病理检查验证亚健康模型是否建立成功。

食欲不振、腹泻、消瘦是亚健康症状表现之一，从体重的变化来看，模型组小鼠28天建模后体重明显低于对照组(P<0.05)。而慢性疲劳、记忆力降低、精神倦怠是亚健康状态最典型的表现，从自主活动分析仪分析的数据显示亚健康组小鼠被干预生物钟无规律后，精神倦怠，不爱走动，明显不如正常组活动量大(P<0.01)；避暗穿梭仪分析小鼠避暗穿梭的次数结果显示，实验组小鼠被电击次数多，即实验组小鼠避暗次数明显低于对照组(P<0.05)，符合记忆力减退这一现象；通过鼠尾悬挂，记录5 min内计小鼠累不挣扎时间，即绝望时间的统计，实验组小鼠时间多于正常组小鼠(P<0.05)，符合心理上的亚健康；从力竭游泳时间上来看，模型组小鼠先沉于水下，易疲劳，体力明显不如对照组小鼠(P<0.05)。亚健康状态是介于健康与疾病的边缘状态，是机体在无器质性病变情况下发生的一些功能性的改变。所以本实验为排除小鼠主要器官并未发生病变，将代谢器官肝、肾，免疫器官胸腺、脾，进行HE染色观察，结果显示无器质病变。

以往单一因素建模如强迫游泳、跑台法，仅仅考虑亚健康中躯体疲劳这一现象，且跑台容易造成尾部或足部挫伤、出血而引起继发感染等症。本建模方法从心理和躯体共同刺激建模，模拟社会竞争激烈，应激刺激，精神压力过大以及过度疲劳、缺乏睡眠等综合成因建立亚健康模型，把握亚健康处于健康与疾病这一边缘状态，时刻防止亚健康小鼠往病态小鼠这一状态转化。通过表观观察以及行为学仪器多功能自主活动分析仪、避暗穿梭测试仪更准确的测定各组小鼠的差异。在建模期间，注意小鼠的饮食饲养环境，按时进行消毒，合理设计时间，即从亚健康的成因及症状综合考虑亚健康成因，又不违反《实验动物保护法》。

综上所述，小鼠处于未病与病态的中间状态。即采用复合因素建立的亚健康模型，小鼠的各项指标符合亚健康的特征。说明该造模方法具有一定合理性，为亚健康模型的进一步探究和改善亚健康的临床药物筛选垫定基础。

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Composite Factors of Establishing the Subhealthy Mice Model

HAOWenli，CHENZhibao，ZHAORui*，BOLe，ZHANGTenglong

(College of Life Sciences，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China)

Abstract：Objective: The purpose of this research is to employ Compound factors to construct mice sub-health model which has analogical clinical symptoms to mankind. Methods: Employed force-swimming, sleep deprivation, restraint stress, tail clipping to construct mice sub-health model and assess the effect through the appearance, behavior experiment and pathological examination. Result: The model group has significant difference compared with the control group in aspect of appearance, weight, autonomic activities, step-through test, tail suspension, force-swimming test(P<0.05). But athology examination shows no significant lesion to the model group. Conclusion: The method of compound factors can establish mice sub-health model.

Key words：compound factors; sub-health model；mice

文章编号：1007-7146(2015)06-0580-04

文献标志码：A

中图分类号：R-332

*通讯作者：赵蕊，硕士生导师，副教授，研究方向是中草药活性成分机制的研究。(电子邮箱)zhaoruier@sina.com

作者简介：郝文丽(1989-)，女，汉， 黑龙江大庆，在读硕士研究生，研究方向是中草药防治疾病的研究。(电话)18645986033;(电子邮箱)598322851@qq.com；

基金项目：中国博士后科学基金2014M551281

收稿日期：2014-12-30;修回日期:2015-06-12

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.015