李红超，舒红英，李晓杰，倪　斌，谢海龙，周海燕，倪　崖*

(1.温州医科大学检验医学院/生命科学学院， 浙江 温州 325035； 2.湖南省计划生育研究所 现代优生技术

湖南省重点实验室， 湖南 长沙 410126； 3.郴州市第一人民医院病理科， 湖南 郴州 423000)

原发性扩张型心肌病的线粒体tRNA基因突变分析

李红超1，舒红英2，李晓杰3，倪斌2，谢海龙2，周海燕2，倪崖1*

(1.温州医科大学检验医学院/生命科学学院， 浙江 温州 325035； 2.湖南省计划生育研究所 现代优生技术

湖南省重点实验室， 湖南 长沙 410126； 3.郴州市第一人民医院病理科， 湖南 郴州 423000)

摘要：为寻找原发性扩张型心肌病病例是否存在已知以及未知的线粒体tRNA致病性突变，以探讨扩张型心肌病可能的发病原因。收集2例原发性扩张型心肌病患者和10例正常对照尸检心肌组织石蜡标本，针对22种线粒体tRNA基因分别设计一对引物，PCR扩增后并测序分析线粒体tRNA基因突变情况。结果在对照样本中未检测到线粒体tRNA变异位点，在1例患者中检测到了tRNAVal基因G1664A变异，Mitomap已有报道为多态性位点；于另1例患者中检测到tRNAMetT4454C变异，有文章报道该位点与线粒体功能障碍有关，Mitomap报道为多态性位点。本研究中2例病例中未检测到线粒体tRNA致病性突变位点，可能与病例个体的心衰程度有关，有必要扩大样本量深入研究线粒体tRNA以及mtDNA其他基因突变与原发性扩张型心肌病之间的关系，以寻找可能的致病突变位点、易感的多态性位点或者单倍体群，为认识原发性扩张型心肌病的发病机制进一步提供理论基础和依据。

关键词：扩张型心肌病；线粒体tRNA基因

0背景

原发性心肌病从形态和功能上分为肥厚型心肌病、扩张型心肌病、限制性心肌病、致心律失常型右心室心肌病和无类别心肌病5种类型[1]。扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一种以心腔(左和/或右心室)扩大、心肌纤维化为主要特征的心肌疾病，其临床表现为进行性心力衰竭(心衰)、心律失常、血栓栓塞，甚至猝死。扩张型心肌病发病达到晚期时，除心脏移植外，没有彻底的治疗方法，该病死亡率较高，5年病死率15%-50%[2]，是心肌衰竭的第三大常见原因[3, 4]，亦是导致儿童及青少年死亡的主要原因。而DCM病因与多种因素有关，如基因突变[5, 6]、病毒感染[7]和自身免疫[8]，其确切的发病机制尚不清楚，鉴于上述，加强对扩张型心肌病的研究，深入了解其发病机制有其必要性和紧迫性。

线粒体是哺乳动物细胞中唯一含有自身遗传物质的细胞器，是真核生物细胞内能量转换体系和供能中心。它含有一个独立的半自主复制的DNA，称为线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。人mtDNA为一16 569 bp的双链闭合环状分子，编码13种呼吸链酶复合物的亚单位、22种tRNA和2种rRNA。线粒体tRNA基因长度仅占整个mtDNA的1/10，但这里集中着50%以上与线粒体疾病相关的突变位点[9,10]。线粒体tRNA与编码氨基酸之比基本是1:1，若某种线粒体tRNA基因发生突变影响其结构功能，而其他tRNA又不能进行补偿，则突变的线粒体tRNA可导致线粒体DNA编码的氧化磷酸化功能相关蛋白翻译过程的众多缺陷[11]，因此，线粒体tRNA基因突变更容易导致氧化磷酸化功能缺陷，引起疾病的发生，这也可能是线粒体tRNA基因成为疾病相关的突变热点区的原因之一。

细胞通过氧化磷酸化产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90%以上，由于心脏对氧化代谢的强大依赖，使得线粒体的结构功能改变在心脏受损中十分重要，因此，探究是否存在线粒体基因致病性改变对心肌病有着重要的研究意义。本研究拟从线粒体DNA角度出发，寻找本实验中的DCM病例是否存在已知以及未知的线粒体tRNA致病性突变，以建立实验室快速筛查线粒体tRNA基因突变的方法，以探讨该DCM病例可能的病因，也为深入了解DCM发病机制奠定基础和提供依据，为DCM的诊断与预防开辟新的途径。

1材料方法

1.1病例资料

于南华大学协作医院郴州一医院病理科收集2例因原发性扩张型心肌病而行移植术患者的心脏和10例尸检心脏心肌组织石蜡标本。患者A：女，21岁，因“活动后心悸气促8个月”入院，临床相关检查：X线检查心脏扩大呈普大型，中度，心尖圆钝，心后缘圆隆，左房压迹增深，心前间隙明显变窄，肺动脉段稍突出。心脏彩超：左室右房增大，考虑扩张型心肌病。病理巨检：心脏标本大小为13 cm×11.7 cm×5 cm，360 g，心瓣膜及乳头肌未见赘生物。三尖瓣瓣环周径为10.8 cm，二尖瓣瓣环周径为10.0 cm，右室壁厚0.3 cm，左室壁厚0.8 cm，室间隔厚1.4 cm。双侧心室腔均明显扩大，右室心下缘至三尖瓣9.5 cm，右室腔横径最宽处为5.5 cm，左室心尖至二尖瓣9.5 cm，最宽处5.0 cm。心肌组织病理学检查结果进一步确认为扩张型心肌病。

图1　 HE染色显示心肌组织(分别×200、×400观察) 可见心肌细胞明显肥大与萎缩，心肌间质间可见小灶纤维化Fig.1　The HE staining showed the myocardial tissue (×200, ×400 vision, respectively) with myocyte hypertrophy and atrophy, and cystic fibrosis between myocardial interstitial cells

患者B：女，36岁，因“活动后心悸气促6年”入院查体，心脏彩超显示：右房右室心腔扩张，右室壁较薄，活动明显减弱，上游离壁明显，附游离壁可见范围7 mm×3 mm×2 mm移动回声光团，右室腔内还可见起搏器中极强回声带。室间隔连续，其基底段呈同向运动，活动度较增强，房间隔连续。左房室不大，室壁不厚，活动减弱。各瓣膜结构不清，瓣叶细，三尖瓣关闭见裂，余各瓣膜开闭可。升主动脉不宽，肺动脉增宽，心包腔未见明显积液。彩色多普勒血流成像显示：心内血彩较暗淡，TV-RA偶见大量返流。返流速达右房中部，返流Vmax0.90 m/s。彩超意见：1、提示心肌病(右室型)；2、右心扩大，疑右室内血栓；3、三尖瓣返流；4、心功能测值SV、SI、CO、CI减低。CR胸位(床旁)成像显示：心影明显增大近似球形，主要表现向左增大，心左缘紧贴左胸腔侧壁，心影占据左胸腔中下部，左膈面显示不清，心胸比值约0.65，肺野及骨性胸廓未发现明显异征，符合扩张型心肌病。临床心脏移植术中也可见：左心房、心室明显扩大，右心室内可见陈旧性血栓，可见起搏导线附着于心肌内。巨检：心脏大小为16 cm×12 cm×5 cm，400 g，左心房明显扩张，肌壁变薄，肌壁厚0.1-0.4 cm，右心耳明显扩张。三尖瓣周径15.5 cm，乳头肌明显增粗，肥大。右室壁厚0.1-0.3 cm，肺动脉瓣周径7 cm，二尖瓣周径6.5 cm，左心室扩张，肌壁厚1.1-1.4 cm，主动脉瓣周径6 cm，室间隔与房间隔无异常。组织病理学检查：心肌细胞不均匀肥大，心肌间质小灶状纤维化，右心耳及右心室内附壁血栓形成，左冠状动脉内膜增厚，管腔轻度狭窄，病变符合扩张性心肌病。

图2　 HE染色显示心肌组织(分别×100、×200)可见心室内附壁血栓形成，心肌细胞肥大与萎缩，心内膜下心肌纤维明显变性Fig.2　The HE staining showed the myocardial tissue (×100, ×200 vision, respectively) with ventricular thrombosis, myocyte hypertrophy and atrophy, and obvious degeneration in myocardium fibrocyte

1.2研究方法

1.2.1DNA提取

采用HiPure FFPE DNA Kit(Magen)从石蜡包埋组织切片中提取总基因组DNA(方法有改进)。用干净刀片去除组织切片周围多余的石蜡，转移切片至1.5 mL离心管中，加入1 mL二甲苯剧烈涡旋20 sec，静置15 min，14 000 g离心2 min，弃上清留沉淀。依次分别用100%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇、双蒸水重悬沉淀10 sec，14 000 g离心，弃上清留沉淀。后续实验操作同试剂盒法。

1.2.2PCR

应用Primer5引物设计软件分别针对22种线粒体tRNA基因设计一对引物。PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL，5 U/μL Ex Taq Polymerase(TaKaRa)0.2 μL，10 μmol/L F/R引物各1 μL，DNA模板3 μL，ddH2O补齐至25 μL。为提高扩增效率和特异性，采用降落PCR：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 sec，62 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，2个反应；95 ℃变性15 sec，60 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，2个反应；95 ℃变性15 sec，58 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，28个反应后72 ℃延伸7 min。反应结束后，取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3测序

PCR产物经琼脂糖电泳确认为特异单一条带后，送往北京睿博兴科生物技术有限公司进行直接测序，所有序列均行正反向测序以验证，测序结果采用CodonCode Aligner4.0.4(http://www.codoncode.com/aligner/download.htm)序列软件进行分析，并与修正后的线粒体基因剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，NC＿012920.1，http://www.mitomap.org)作比对，查找相应tRNA基因突变情况以及扩增的目的片段是否准确，并进一步核对测序峰图确保无误。

2结果

PCR产物测序结果比对分析显示，在患者A的tRNAVal基因1664位点检测到了G→A变异(如图3所示)，而在患者B和10例对照样本里均未检测到这一位点变异，该变异位点在Mitomap上有报道，为多态性位点。

图3　患者A中线粒体tRNAVal基因序列(1664G→A) 示患者A、患者B、对照样本9号与mtDNA剑桥参考序列的比对分析结果Fig.3　The sequence of mitochondrial tRNAVal gene of No.A patient (G1664A variation) The results of alignment analysis from the sequence of patient A, patient B, control sample No.9 and mitochondrial reference sequence

在患者B的tRNAMet基因的4454位点检测到了4454T→C变异(如图4所示)，而在患者A和10例对照样本里均未检测到这一位点变异。

tRNA基因侧翼序列分析结果显示(如表1)10398A→G、12358A→G、12372G→A变异在患者和对照心肌组织中均有检测到，10400C→T、14766C→T、14783T→C变异仅在对照样本中检测到，而未在患者石蜡组织中检测到。其中A10398G、C10400T位点为线粒体DNA单倍体型N、M群分型的标志性位点[12]，A12358G、G12372A、C14766T、T14783C均为线粒体DNA多态性位点，在Mitomap、PhyloTree等数据库上均有报道。

表1DCM患者和对照样本中tRNA基因和其侧翼编码序列分析

Tab.1The analysis of mitochondrial tRNA gene and flank coding sequence from DCM patients and controls

基因位点患者标本对照是否报道tRNA基因G1664A(tRNAVal)A-是T4454C(tRNAMet)B-是tRNA基因侧翼A10398G(ND3,T114A)A、B7、8是编码序列C10400T(ND3,syn)-7是A12358G(ND5,)A8是G12372A(ND5,syn)A8是C14766T(CytB,I7T)-1、2、4、5、6、7、8、9、10是T14783C(CytB,syn)-1、2、3、4、5、7、9是

tRNAVal基因1664位点位于tRNAValACC端的接受茎上，tRNAMet4454位点位于tRNAMetT环上(如图5所示)，17种灵长类动物在这两个位点的保守性分析显示，这两个位点的保守性指数均低于50%，保守性低，可能该位点变异对tRNA二级结构的正确折叠影响比较小。

图5　线粒体tRNAVal和tRNAMet二级结构图 箭头分别指示本实验中筛查到的tRNAValG1664A和tRNAMetT4454C变异位点Fig.5　The secondary structure of mitochondrial tRNAVal and tRNAMet The arrow show that mitochondrial tRNAVal gene G1664A variation and tRNAMet gene T4454C variation screened in this study

3讨论

本研究建立了针对22个线粒体tRNA基因快速筛查的方法，此方法针对性强，比较适合于非新鲜长久保存的样本。目前病理科室制备石蜡组织切片多为福尔马林固定，受到固定时间、温度以及组织处理过程的影响，从石蜡块中提取的DNA，长度大部分在100-1 000 bp之间，而贮存10年以上的标本会存在明显的降解[13]。本实验取到的标本为石蜡组织切片，实验过程中亦发现有明显的降解而影响长片段的扩增，因此本实验针对22个tRNA设计引物进行筛查，为研究线粒体tRNA基因与疾病的关系奠定了方法学基础。

本实验中筛查得到的tRNAMetT4454C变异位点，Mitomap报道为多态性位点，有文章报道该位点变异与线粒体功能障碍有关，与高血压相关，但这一结论尚存在争议。Zhu等[14]研究报道从270例原发性高血压中国人群中检测到了T4454C变异，功能分析显示该变异位点可能导致tRNA3'末端代谢缺陷或者呼吸链重要亚基的损害，并且发现携带此变异位点的永生化淋巴细胞的氧耗速率明显低于对照细胞(P=0.0010)，预示该变异位点可能与中国人群原发性高血压有关。而Wang等[15]针对该报道进行了修正，认为Zhu等发表的携带T4454C变异位点的病例线粒体全序列数据不够充分，不能够划分其单倍体型，可能与所报道的中国人群不一致，且利用MFOLD系统分析了tRNAMet二级结构，4454T和4454C位点的自由能非常接近，均比较低，说明该位点变异后tRNAMet二级结构亦比较稳定，质疑T4454C变异与中国人群原发性高血压之间的相关性。因此，有关该位点变异与线粒体功能或疾病之间的关联尚需深入研究以阐明。

本研究对2例DCM病例和10例对照样本进行了筛查，未检测到新的线粒体tRNA致病性突变位点，这可能与病例个体的心衰程度有关。Marin-Garcia等[16]在28个散发的严重DCM患者中发现了线粒体tRNA突变，并导致了氨基酸结构或是核苷酸的变化。Cardena等[17]在一个重度心衰的DCM患者中发现mtDNA16018-16032位点之间存在15bp的核苷酸序列重复，其中部分区域在编码脯氨酸tRNA的基因(tRNAPro)上，这一位置对保护细胞对抗氧化起着重要的作用。这种重复可能改变tRNAPro的稳定性或二级结构，影响线粒体蛋白质的合成。Wahbi等[18]发现，纯扩张型表型常见于患者mtDNA8344A>G，约20%的这类患者存在左心室功能障碍。Stalder等[19]发现存在A3243G突变的患者具有严重的心衰症状、显著低EF值，并伴有听力下降、代谢紊乱等特点。还有很多临床案例都显示了在DCM患者中，尤其是在严重型或者其他类型心肌病患者中，都能检测mtDNA突变，又以各型tRNA异质性突变为主，他们均不同程度地改变了氨基酸、核苷酸或tRNA的结构而致病。以上已报道病例的共同特点是心衰比较严重，而本研究样本量小，由于涉及到伦理学问题，心肌病患者心肌组织样本很难取材，本实验取到的是十年前进行心脏移植术后的石蜡样本，2例患者术后尚正常，本实验中未筛查到tRNA致病性突变位点，可能与患者个体心肌衰竭相关临床指征的严重程度有关。

本研究从病例中筛查得到的tRNAVal基因G1664A和tRNAMetT4454C变异位点，MITOMAP已有报道这两个位点均为多态性位点，而本实验在线粒体tRNA基因侧翼序列检测到的其他变异位点亦为多态性位点，由于受到样本量小的局限性，无法对病例进行大样本量研究和利用多态性位点进行单倍体群划分，因此，我们仍需扩大样本量，深入研究线粒体tRNA以及mtDNA其他基因突变与原发性扩张型心肌病之间的关系，以寻找可能的致病突变位点、易感的多态性位点或者单倍体群，为认识原发性扩张型心肌病的发病机制进一步提供理论基础和依据。

参考文献

[1]HUGHES S E, MCKENNA W J. New insights into the pathology of inherited cardiomyopathy [J]. Heart, 2005, 91(2):257-264.

[2]KOMAJDA M, JAIS J P, REEVES F,etal. Factors predicting mortality in idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. Eur Heart J, 1990, 11(9):824-831.

[3]TSAGALOU E P, ANASTASIOU-NANA M, AGAPITOS E,etal. Depressed coronary flow reserve is associated with decreased myocardial capillary density in patients with heart failure due to idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. J Am Coll Cardiol, 2008, 52(17):1391-1398.

[4]SKALIDIS E I, PARTHENAKIS FI, PATRIANAKOS A P,etal. Regional coronary flow and contractile reserve in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. J Am Coll Cardiol, 2004, 44(10):2027-2032.

[5]FEIGENBAUM A, BAI R K, DOHERTY E S,etal. Novel mitochondrial DNA mutations associated with myopathy, cardiomyopathy, renal failure, and deafness [J]. Am J Med Genet A, 2006, 140(20):2216-2222.

[6]TESSA A, VILARINHO L, CASALI C,etal. MtDNA-related idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. Eur J Hum Genet, 1999, 7(8):847-848.

[7]FUJIOKA S, KITAURA Y, TERASAKi F. Etiology and quantitative evaluation of viral infection in the myocardium of patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. J Mol Cell Cardiol, 2008, 45(4):S33.

[8]JAHNS R, BOIVIN V. Direct evidence for a betal-adrenergic receptor directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. J Clin Invest, 2004, 113(10):1419-1429.

[9]BRANDON M C, LOTT M T, NGUYEN K C,etal. MITOMAP:a human mitochondrial genome Database-2004 update [J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33:D611-D613.

[10] MITOMAP. http://www.mitomap.org

[11]SUZUKI T, NAGAO A, SUZUKI T. Human mitochondrial tRNAs:biogenesis, function, structural aspects, and diseases [J]. Annu Rev Genet, 2011, 45:299-229

[12]QUINTANA-MURCI L, SEMINO O, BANDELT H J,etal. Genetic evidence of an early exit of Homo sapiens sapiens from Africa through eastern Africa [J]. Nat Genet, 1999, 23(4):437-441.

[13]KOSHIBA M, OGAWA K, OGAWA O,etal. The effect of formalin fixation on DNA and the extraction of high molecular weight DNA from fixed and embedded tissues [J]. Path Res Pract, 1993,189(1):66-72.

[14]ZHU H Y, SHI W W, LI L,etal. Genetic variants in mitochondrial tRNA genes are associated with essential hypertension in a Chinese Han population [J]. Clinica Chimica Acta, 2009, 410(1-2):64-69.

[15]WANG Y, DONG P, LI L,etal. The mitochondrial tRNAMet4454T>C variant may not be associated with essential hypertension in Han Chinese population [J]. Mitochondrial DNA, 2014, 25(2):124-125.

[16]MARIN-GARCIA J, GOLDENTHAL M J, ANANTHAKISHNAN R,etal. The complete sequence of mtDNA genes in idiopathic dilated cardiomyopathy shows novel missense and tRNA mutations [J]. J Card Fail, 2000, 6(4):321-329.

[17]CARDENA M M, MANSUR A J, PEREIRA ADA C,etal. A new duplication in the mitochondrially encoded tRNA proline gene in a patient with dilated cardiomyopathy [J]. Mitochondrial DNA, 2014, 24(1):46-49.

[18]WAHBI K, LARUE S, JARDEL C,etal. Cardiac involvement is frequent in patients with the m.8344A_G mutation of mitochondrial DNA [J]. Neurology, 2010, 74(8):674-677.

[19]STALDER N, YAROL N, TOZZI P,etal. Mitochondrial A3243G mutation with manifestation of acute dilated cardiomyopathy [J]. Circ Heart Fail, 2012, 5(1):e1-3.

Mutation Analysis of Mitochondrial tRNA Gene in Patients with Primary Dilated Cardiomyopathy

LIHongchao1,SHUHongying2,LIXiaojie3,NIBin2,XIEHailong2,ZHOUHaiyan2,NIYa1*

(1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China;2.Key Laboratory of Genetics and Birth Health of Hunan Province, Family Planning Institute of Hunan Province,Changsha 410126, Hunan, China; 3.Department of Pathology, the First Hospital of Chenzhou City,Chenzhou 423000, Hunan, China)

Abstract：To identify the potential pathogenic mutations of mitochondrial tRNA in patients with primary dilated cardiomyopathy(DCM)and the possible association of the mutations with DCM. Paraffin-embedded myocardial tissues from two patients with DCM and 10 healthy controls,which were discarded after forensic examination, were used for the study. PCR amplification wasperformed for the mitochondrial tRNA genes and direct sequencing was conducted. Sequencing results showed no variation for mitochondrial tRNA genes in the normal myocardial tissues. The tRNAValG1664A variation and tRNAMetT4454C variation were identified in patients with DCM. These two variations were previously reported as polymorphism in MitoMap. There was no pathogenic mutation detected in mitochondrial tRNA genes of the two patients with DCM. A patient pool of large sample size is expected for analysis of the pathogenic mutations, polymorphism loci and haplogroup that might be associated with DCM.

Key words：dilated cardiomyopathy; mitochondrial tRNA gene

文章编号：1007-7146(2015)06-0539-06

文献标志码：A

中图分类号：R715.5

*通讯作者：倪崖，硕士，研究员，主要从事精子细胞功能及其信号传导的研究。(电话) 0571-88215505；(电子邮箱)niya99@126.com

作者简介：李红超(1982-)，男，河南南阳人，硕士研究生，临床检验诊断专业。(电话)0731-89762261)；(电子邮箱)hongchao800@126.com

基金项目：湖南省科技厅科技计划一般项目(2013SK3295)

收稿日期：2015-11-02;修回日期:2015-11-15

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.009