丁军颖，桂 红，洪燕英，安世栋，丁雪菲，卢幼然，刘清泉

铜绿假单胞菌属于革兰阴性杆菌，在健康人群的呼吸道、肠道和皮肤中广泛存在，是临床常见的条件致病菌，可导致全身或局部化脓性感染，严重者可危及生命。随着临床治疗手段的改善和提高，许多创伤性和介入性的治疗方法被应用于临床，加之抗生素逐步升级，使得铜绿假单胞菌感染率明显升高且耐药性日趋严重［1］。外膜蛋白D2(OPRD2)的缺失是铜绿假单胞菌对抗生素产生耐药性的主要原因。目前，对此类耐药机制的研究主要集中于实验株，而关于临床分离株的研究报道较少见［2］。本研究对首都医科大学附属北京中医医院2014年感染病例的送检标本进行病原菌分离，统计分析铜绿假单胞菌的分布情况，检测临床分离株中全耐药菌株的OPRD2耐药基因的表达，分析其与耐药的相关性，以期为临床合理用药，降低感染率，减少耐药扩散提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 搜集2014年1—12月首都医科大学附属北京中医医院感染病例的所有送检样本15 620例。

1.2 诊断标准 依据卫生部2001年1月颁布的医院感染诊断标准进行临床诊断。

1.3 病原菌的分离及鉴定 搜集全院感染病例的所有送检标本，包括痰、咽拭子、血、脓及创口分泌物、引流物等，分离病原菌并进行革兰染色(试剂购自天津市金章科技发展有限公司)，结合镜下形态鉴定，进一步培养分离得到铜绿假单胞菌(弃掉同一病例的重复病原菌)，以备检测其药物敏感性。

1.4 铜绿假单胞菌药敏试验 采用COMPACT VITEK-2全自动微生物鉴定系统对铜绿假单胞菌进行菌种鉴定，并进行最小抑菌浓度(MIC)检测。菌种鉴定质控标准菌株为阴沟肠杆菌ATCC700323，MIC检测质控标准菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，均购自卫生部临床检验中心。对20种抗菌药物均耐药的铜绿假单胞菌定为全耐药菌株。

1.5 全耐药菌株的耐药基因检测 采用聚合酶链反应(PCR)检测全耐药菌株的OPRD2耐药基因的表达，引物序列如下，F:GCGCATCTCCAAGACCATG;R:GTTGTCGGTGATCGCGTAGC，扩增片段预期长度为252 bp。

2 结果

2.1 样本感染情况 15 620例感染样本中分离非重复病原菌5075株，革兰阴性菌3070株，铜绿假单胞菌332株，占6．54%。

2.2 菌株分布特点

2.2.1 样本形式:332株铜绿假单胞菌，主要来源为痰标本116株，占34．94%。

2.2.2 科室分布:铜绿假单胞菌在各科室分布广泛，几乎各科室均有铜绿假单胞菌感染样本，其中，以疮疡外科、呼吸科、重症监护室、综合保健科和肾内科最为多见。铜绿假单胞菌分布居前10位的科室见表1。

2.3 铜绿假单胞菌耐药情况分析 332株铜绿假单胞菌对20种不同抗菌药物的耐药率差异较大。其中，对头孢唑啉的耐药率最高，为99．4%。对阿米卡星的敏感率最高，为95．4%;其次为哌拉西林/他唑巴坦，为90．6%。铜绿假单胞菌对各药的耐药情况见表2。

表1 铜绿假单胞菌比例居前10位的科室分布情况

表2 332株铜绿假单胞菌对抗生素的耐药情况

2.4 全耐药铜绿假单胞菌的耐药相关基因表达本研究分离获得的332株铜绿假单胞菌对20种抗菌药均耐药的有9株，占2．71%。此9株铜绿假单胞菌耐药基因OPRD2的表达结果见图1。

图1 对20种抗生素均耐药的铜绿假单胞菌OPRD2基因表达Marker:DL2000;P:阳性对照;A～I:样本1～9

3 讨论

铜绿假单胞菌是院内获得性感染的重要致病菌，在医院获得性肺炎(HAP)中占第二位［3］。临床统计其耐药率显著上升，导致相关治疗越来越棘手。本研究分离的铜绿假单胞菌主要来源于痰标本，表明其主要引起呼吸道感染。这与张栩［4］的研究一致，提示未来耐药铜绿假单胞菌的研究和治疗应主要着眼于呼吸系统的疾病。

已知铜绿假单胞菌存在天然耐药，随着抗生素的应用使铜绿假单胞菌出现获得性耐药和适应性耐药［5］，且三种耐药机制可能同时存在［6］。在铜绿假单胞菌耐亚胺培南的突变株上已证明，外膜通透性降低是由于外膜缺失一种分子量为45～46 kD蛋白OPRD。如将此基因重组于缺陷OPRD的突变株外膜蛋白脂质体中，又可使亚胺培南透过性增加5倍以上，其MIC也相应地降低，细菌耐药性也随即消除。所以，OPRD2耐药基因表达是影响其耐药性的关键因素［7-9］。沈继录等［10-11］以 SDS-PAGE 检测铜绿假单胞菌的外膜蛋白，发现亚胺培南耐药株的OPRD2明显低于亚胺培南敏感株，也证实铜绿假单胞菌中外膜蛋白表达量的减少或缺失是其对亚胺培南耐药的重要机制。本研究也发现，临床分离的铜绿假单胞菌菌株中，对20种抗生素均耐药的9株菌，其OPRD2耐药基因表达率也并非100%，所以提示仍有通透性高的药物可用于临床治疗。

本研究发现，2014年临床分离的铜绿假单胞菌对头孢唑啉的耐药率最高，对阿米卡星的敏感率最高。有研究报道，亚胺培南被视为控制革兰阴性菌感染的最佳抗菌药物［12］，但本研究结果与报道不一致。本研究显示，铜绿假单胞菌对阿米卡星敏感率最高，也许与样本仅来源于本院，有一定局限性有关。已知亚胺培南可与青霉素结合蛋白结合，抑制细胞壁合成，从而导致细菌溶解死亡，且其对β-内酰胺酶稳定，曾是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物之一［13-15］。但由于该类药在临床大量使用，耐药率也在逐年上升，这也不难解释本研究临床分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南并非最敏感。提示临床使用亚胺培南治疗的原则应适当调整，以适应逐年上升的耐药率［16］。另外，阿米卡星是氨基苷类抗菌药物，其抗菌谱是氨基苷类抗菌药物中最广的，对铜绿假单胞菌有较好的抑菌作用。有研究对细菌耐药进行监测显示，阿米卡星敏感性高达95%［17］，本研究结果与此一致。提示阿米卡星临床治疗的可用性。

综上所述，在关注铜绿假单胞菌耐药基础研究的同时，有必要对临床分离的铜绿假单胞菌进行更广泛的耐药机制探索研究，以便寻找切实的治疗策略［5-6，18］。

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