杨 巍 ，任雪娇，崔学宇，慈佳宾，任启彪，杨伟光,吴春胜

(1 吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118；2 吉林省种子管理总站，吉林 长春 130062)

玉米单倍体诱导系JS6-2诱导效果的研究

杨 巍1，任雪娇1，崔学宇1，慈佳宾1，任启彪2，杨伟光1,吴春胜1

(1 吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118；2 吉林省种子管理总站，吉林 长春 130062)

【目的】 探讨玉米单倍体诱导系JS6-2对不同基础材料、不同授粉时期和果穗不同部位的诱导效果，为玉米单倍体育种技术的应用提供理论依据。【方法】 以玉米单倍体诱导系JS6-2为诱导材料，Stock6和农大高诱1号为对照，对不同基础材料进行了杂交诱导，同时比较了不同授粉时期、不同果穗部位对单倍体诱导率的影响。【结果】 JS6-2对自交系及杂交种均具有诱导产生单倍体的能力，对自交系诱导中，JS6-2单倍体诱导率(8.29%)明显高于农大高诱1号(1.70%)和Stock6(0.66%)；对杂交种诱导中，JS6-2单倍体诱导率(8.22%)同样明显高于其他2个诱导系(1.35%和0.76%)。JS6-2杂交诱导单倍体最佳时期为雌穗吐丝后3～8 d；果穗顶部的单倍体诱导率(6.87%)高于底部(5.61%)。【结论】 玉米单倍体诱导系JS6-2的诱导效果明显好于农大高诱1号和Stock6；Reid、No Reid材料以及Reid×DOM和No Reid×DOM杂优模式材料的单倍体诱导率高；田间杂交诱导时，建议在雌穗吐丝3～5 d整齐剪断花丝进行杂交诱导，单倍体诱导效果好。

玉米；单倍体诱导系；诱导效果

玉米单倍体育种(Haploid Breeding)技术是传统育种技术的革命，与分子育种技术、转基因技术形成了现代玉米育种技术的新体系[1-4]。国内外各大公司、科研院所和高等院校相继开展了玉米单倍体育种，以加速培育玉米优良自交系、育成新品种步伐，并应用于玉米育种实践[5]。然而玉米单倍体育种受两个因素限制：一是难以获得足够数量的单倍体，即单倍体诱导率低，Stock6仅为3%[6-9]；二是单倍体二倍化困难，即加倍率低，单倍体植株的自然加倍率仅在0.4%～1.2%[10]。玉米单倍体诱导效率的提高可以大大提升单倍体育种的效率，同时可以节约育种成本[11-12]。因此，如何提高单倍体诱导效率一直是人们探索的重要课题。研究表明，单倍体诱导率的高低与不同基础材料及杂交组合的双亲有关；同一父本诱导系对不同母本杂交诱导产生的单倍体频率均存在着显著差异[6,9]。本研究以自选单倍体诱导系JS6-2为父本，Stock6和农大高诱1号为对照，研究诱导系JS6-2对玉米不同母本基因型材料、不同授粉时期、果穗不同部位的诱导效果，以期为玉米单倍体育种奠定基础。

1 材料与方法

供试材料为吉林农业大学2007年以Stock6/吉高诱3为基础材料，采取南北穿梭育种，于2010年育成的诱导率高、遗传标记明显的高频率单倍体诱导系JS6-2。Stock6和农大高诱1号(Cau ho 1)为外引诱导系。本试验共进行如下3方面处理。

1.1 不同母本基础材料对单倍体诱导率的影响

用于诱导的基础材料包括自交系和杂交种2种，其中，10个骨干自交系为2011年由中国东北春玉米区选择，10个杂交组合为10个自交系以不同杂种优势模式组配而成(表1)。

注：DOM为旅大红骨群+塘四平头群。表2同。

Note:DOM stands for Lüda Red Cob and Tangsipingtou germplasms.The same for table 2.

2012年夏，于吉林农业大学种子工程玉米育种基地，以基础材料为母本，JS6-2、Stock6、农大高诱1号为父本，于母本吐丝后3～4 d后进行杂交诱导。每个基础材料10～20穗，收获后挑选无色胚芽尖、紫色粒顶的籽粒为准单倍体。2012年冬，于吉林农业大学海南育种基地，结合植株标记进行进一步的田间鉴定。依据田间鉴定结果统计单倍体诱导率。单倍体诱导率=(准单倍体粒数/杂交总粒数)×100%。

1.2 不同授粉时期对单倍体诱导率的影响

2012年和2013年，于吉林农业大学海南育种基地，以郑单958、吉农玉833、农华101、吉农玉719为母本，父本诱导系为JS6-2，选择不同授粉时期进行授粉。根据母本雌穗吐丝后的时间进行授粉时期的划分：剪开苞叶授粉定义为0 d，刚吐丝时定义为1 d，依次往后记录吐丝后的时间。具体分为以下3个处理：早期授粉0～2 d，中期授粉3～5 d，晚期授粉6～8 d。单倍体统计与鉴定同1.1节。

1.3 不同果穗部位单倍体诱导率的差异

2012年冬，选用5个杂交种郑单958、先玉335、利民33、农华101、吉农玉833，种植于吉林农业大学海南三亚育种基地，其遗传基础见表2。以诱导系JS6-2为父本，杂交诱导各杂交种30穗。收获后选择结实性好的果穗，按底部(约为果穗长度的1/2)和顶部(同上)分开脱粒。脱粒后根据籽粒遗传标记进行单倍体的初步鉴定。2013年夏，在吉林长春对单倍体进行进一步的种植鉴定，具体鉴定方法同1.1节。

2 结果与分析

2.1 单倍体诱导系JS6-2对不同玉米基础材料的诱导效果

2.1.1 诱导系JS6-2对不同自交系的诱导效果 诱导系JS6-2、Stock6和农大高诱1号对不同玉米自交系的诱导效果见表3。由表3可知，诱导系JS6-2、Stock6和农大高诱1号对玉米自交系均具有产生孤雌生殖单倍体的能力，其中JS6-2的平均单倍体诱导率为8.29%，农大高诱1号的平均单倍体诱导率为1.70%，Stock6的平均单倍体诱导率最低，为0.66%。JS6-2的单倍体诱导率极显著高于其他2个诱导系，而农大高诱1号与Stock6的单倍体诱导率无显著差异。

注：不同大写字母表示0.01水平下差异极显著，不同小写字母表示0.05水平下差异显著。下表同。

Note:Capital letters stand for significant difference at 0.01 level,while small letters stand for significant difference at 0.05 level.The same below.

不同母本基础材料的单倍体诱导率存在显著差异。JS6-2对自交系材料诱导中，PH4CV的单倍体诱导率最高，为9.86%，吉853的单倍体诱导率最低，为5.69%，变异幅度4.17%。Stock6对自交系材料诱导中，郑58的单倍体诱导率最高，达到1.64%，吉853、S122的单倍体诱导率最低，为0，变异幅度1.64%。农大高诱1号对自交系材料诱导中，郑58和PH4CV的单倍体诱导率较高，达到3.19%和3.18%，吉853的单倍体诱导率最低，为0，变异幅度3.19%。

2.1.2 诱导系JS6-2对不同杂交组合的诱导效果 单倍体诱导系JS6-2、Stock6和农大高诱1号对不同杂交组合的诱导效果见表4。由表4可知，3个诱导系中对杂交组合的平均单倍体诱导率同样以JS6-2最高，为8.22%；其次是农大高诱1号，为1.35%；Stock6最低，为0.76%。JS6-2的单倍体诱导率同样极显著高于其他2个诱导系，其他2个诱导系的单倍体诱导率无显著差异。

JS6-2对不同杂交材料诱导中， PH6WC×S122、PH4CV×PHB1M、PHB1M×丹340的单倍体诱导率较高，分别为10.13%，9.93%和9.79%，PHGJ4×丹340最低，单倍体诱导率为4.97%,变异幅度5.16%。Stock6单倍体诱导率最高的组合为PHB1M×丹340，诱导率1.33%，最低的PHB1M×S122，诱导率0，变异幅度1.33%。农大高诱1号单倍体诱导率最高的组合为PHB1M×丹340，诱导率2.71%，最低的组合为PHB1M×S122，诱导率0.81%，变异幅度1.90%。

综上所述，单倍体诱导系JS6-2对母本基础材料的诱导率极显著高于其他2个诱导系。不同基础材料存在差异，自交系中，Reid、No Reid材料诱导率高，而DOM则低；杂交种中，Reid×DOM、No Reid×DOM以及Reid、No Reid群内诱导率高，而DOM则低。因此，选用适当基础材料对提高单倍体诱导率有一定作用。

2.2 不同授粉时期对单倍体诱导率的影响

不同授粉时期JS6-2对不同材料单倍体诱导率的影响结果见表5。由表5可以看出，不同授粉时期JS6-2杂交诱导单倍体以雌穗吐丝后3～5 d、6～8 d的单倍体诱导率较高，分别为8.56%和8.75%，极显著高于0～2 d的单倍体诱导率(5.19%)。说明JS6-2杂交诱导单倍体最佳时期为雌穗吐丝后3～8 d。此时雌穗花丝基本全部吐出，便于整齐剪断进行杂交。由于雌穗吐丝3～5 d单倍体结实率较6～8 d高，推荐雌穗吐丝3～5 d进行杂交诱导。不同品种(杂交组合)在不同杂交诱导授粉时期诱导率没有显著差异。

2.3 果穗不同部位对单倍体诱导率的影响

由表6可知，郑单958、先玉335和吉农玉833等3个杂交种果穗顶部的单倍体诱导率均明显高于底部，其中郑单958果穗顶部和底部的单倍体诱导率分别为7.93%和5.45%，先玉335果穗顶部和底部的单倍体诱导率分别为8.05%和5.31%，吉农玉833果穗顶部和底部的单倍体诱导率分别为8.31%和6.15%。而利民33和农华101果穗顶部的单倍体诱导率低于底部，其中利民33果穗顶部和底部的单倍体诱导率分别为4.80%和5.02%，农华101果穗顶部和底部的单倍体诱导率分别为5.72%和 6.11%；但底部与顶部的单倍体诱导率相差不大。综合5个品种果穗顶部与底部来看，果穗顶部的单倍体诱导率(6.87%)高于底部(5.61%)。

综合整个果穗平均单倍体诱导率同样发现，不同品种(不同基础材料)的单倍体诱导率存在差异。本研究中吉农玉833最高，为7.23%，利民33最低，为4.91%，差异显著。前者杂优模式是Reid×DOM，后者杂优模式是Reid×No Reid。

3 讨 论

3.1 单倍体诱导系JS6-2的诱导效果

自1956年Coe育成单倍体诱导系Stock6，Chang提出玉米单倍体育种的流程之后，国内外育种单位与机构相继开展了玉米单倍体育种工作。如杜邦先锋、孟山都等国际公司已经大规模运用，实现了“工厂化”，但在主要技术上存在严重缺陷，其中，单倍体诱导率及加倍率低是限制玉米单倍体育种的瓶颈。

2010年吉林农业大学对Stock6进行了遗传改良，从中选育出新的单倍体诱导系JS6-2。本研究在2012年至2013年，以玉米单倍体诱导系JS6-2为材料，Stock6和农大高诱1号为对照，研究了诱导系JS6-2对不同基因型材料的诱导效果，结果表明，JS6-2对玉米自交系及杂交种均具有诱导产生单倍体的能力，JS6-2的诱导率(8.22%～8.29%)明显高于农大高诱1号和Stock6。JS6-2诱导率高，农艺性状优良，抗玉米大斑病强，花粉量大，为较好的单倍体诱导系。该诱导系的育成，对玉米单倍体育种将具有一定作用。

3.2 玉米单倍体育种中母本基因型的选择

不同母本基础材料的单倍体诱导率和加倍率存在显著差异[2-3,13]。本研究结果表明，不同母本基因型材料间单倍体诱导率差异显著，自交系中，Reid、No Reid群诱导率高；杂交种中，Reid×DOM、No Reid×DOM 杂优模式诱导率高。这与Rober等[14]、刘志增等[15]的研究结果相一致。Chase[16]认为这种影响源于母本基因型所产生的雌配子中有害基因频率的不同。

3.3 杂交诱导授粉时期和授粉部位的选择

本研究结果表明，在雌穗吐丝中期(3～5 d)、晚期(6～8 d)杂交授粉的单倍体平均诱导率高。 Chase[17]、Seaney[18]的研究结果均表明，通过延迟授粉的手段可以提高单倍体的诱导率。田间杂交实践表明，中期授粉的结实率常高于中后期授粉的结实率，因此认为田间杂交诱导时，雌穗吐丝后3～4 d整齐剪断花丝，4～5 d进行杂交诱导，效果更好。

本研究亦发现果穗顶部籽粒的单倍体诱导率高于底部。这与Sarkar等[19]、Chalyk[20]、Rotarenco等[21]的研究结果相类似。推测位于果穗顶部的未成熟卵细胞较果穗下部的成熟卵细胞在未受精的情况下更容易发育成单倍体幼胚[20]。玉米花丝是逐步伸长的，由于在生长过程中花丝直径增大，授粉后在下部花丝中可能有更多的花粉管通向胚囊，尽管诱导系花粉的精子与极核结合形成单授精，可能有其他花粉的精子进入胚囊作为补偿精子与卵细胞结合，进而形成异核受精而完成双授精，这可能造成果穗下部诱导率较果穗上部低。

4 结 论

1)玉米单倍体诱导系JS6-2对玉米自交系及杂交种均具有诱导产生单倍体的能力，其诱导效果明显高于农大高诱1号和Stock6。

2)不同基因型材料间的单倍体诱导率存在显著差异，自交系中，Reid、No Reid群诱导率高；杂交种中，Reid×DOM、No Reid×DOM杂优模式的单倍体诱导率高。

3)雌穗吐丝后3～5 d的中期授粉，单倍体诱导率高于早期授粉。因此建议田间杂交诱导时，雌穗吐丝后3～4 d整齐剪断花丝，3～5 d进行杂交，单倍体诱导效果更好。

4)果穗顶部的单倍体诱导率高于底部。

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Induced rate of maize haploid inducer JS6-2

YANG Wei1,REN Xue-jiao1,CUI Xue-yu1,CI Jia-bin1,REN Qi-biao2,YANG Wei-guang1,WU Chun-sheng1

(1CollegeofAgronomy,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin130118,China；2JilinSeedAdministrationStation,Changchun,Jilin130062,China)

【Objective】 Induction effects of maize haploid inducer JS6-2 with different germplasms,artificial pollination times and sites were studied to improve maize haploid breeding.【Method】 Using JS6-2 as inducing line and Stock6 and Cau ho 1 as control,induction rates between inbred lines and hybrids with different artificial pollination times and sites of ear were compared.【Result】 JS6-2 had the ability of inducing inbred lines and hybrids.The induction rates of JS6-2 for inbred lines and hybrids were higher than Cau ho 1 and Stock6.The average induction rates for inbred lines were 8.29%,1.70% and 0.66%,while those for hybrids were 8.22%,1.35% and 0.76%,respectively.【Conclusion】 JS6-2 was much more efficient than Cau ho 1 and Stock6 in induction of inbred and hybrid lines.Reid,No Reid,Reid×DOM,and No Reid×DOM had high induction rates.Optimal artificial pollination period for inducer JS6-2 was 3-5 d after silking at top site of ear.

maize;haploid induce lines;effect of induction

2014-11-11

吉林农业大学科研启动基金项目(201204)；国家“863计划”项目(2011AA10A103)；农业部948项目(2011-G1-21)；国家农转资金项目(2014GB2B100006)；吉林省现代农业产业技术体系项目(2013001J-1)；国家转基因重大专项(2014ZX800305B)；国家科技支撑计划项目(2014BAD01B01)

杨 巍(1981-)，男，吉林白山人，助理研究员，博士，主要从事玉米遗传育种及作物栽培研究。 E-mail：davidyoung588@126.com

杨伟光(1960-)，男，吉林梨树人，教授，博士生导师，主要从事玉米遗传育种研究。E-mail：ywg789@126.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.004

S335.4；S513.035.2

A

1671-9387(2015)07-0089-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.004.html