吉尚雷，张培军，卢玉婷，王建超，李月红

(1 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2 吉林省卫生监测检验中心，吉林 长春130000)

传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

吉尚雷1，张培军2，卢玉婷1，王建超1，李月红1

(1 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2 吉林省卫生监测检验中心，吉林 长春130000)

【目的】 克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因，构建原核表达载体，并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况，为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】 设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增，将扩增产物克隆到pGEM-T Easy 载体上，构建重组质粒pGEM-T Easy-G，经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后，将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上，构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G，转化至宿主菌BL21中，诱导表达目的蛋白，采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】 成功克隆了IHNV G蛋白基因，该基因长度为1 527 bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G，诱导表达出约76 ku的产物，与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示，所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示，小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】 成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统，重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

传染性造血器官坏死病病毒；G蛋白；原核表达；免疫原性

传染性造血器官坏死病 (Infectious haematopoietic necrosis，IHN) 是一种能引起鳟鱼和鲑鱼以肾脏和脾脏造血组织坏死为主要特征的严重传染病[1]。该病的病原为传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，隶属弹状病毒科诺拉弹状病毒属，为负链RNA病毒[2]，是弹状病毒的典型代表[3]。IHN主要危害鱼苗及种鱼，死亡率可高达100%，对各国水产养殖业都有着严重的影响，是鱼类口岸第一类检疫对象，被我国列为二类动物疫病。IHN最早流行于美国西北部太平洋地区，后来在欧洲、日本也检测到IHNV[4]。IHN于1990年在辽宁本溪大规模暴发，死亡率近100%[5]。近几年，随着我国鲑鱼养殖业的发展，深入研究IHNV对于IHN的检测、预防及疫苗和诊断试剂盒的研制开发都具有重要意义。

IHNV主要通过水平传播感染宿主，苗种期患过IHN后残留的带病毒鱼是主要传染源[6]。目前还没有有效治疗IHNV的商品化药物。糖蛋白即G蛋白，由509个氨基酸组成，蛋白分子质量约为56 ku,是病毒的主要抗原[7-8]，与病毒的毒力直接相关[9]，并且在细胞受体与病毒识别结合过程中起着十分重要的作用[10-11]。为了研究吉林地区分离的IHNV CJ-13株的生物学特性，本研究对CJ-13株G蛋白基因进行了克隆和原核表达，旨在为IHNV基因工程疫苗及快速诊断试剂盒的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒与菌株

IHNV CJ-13株为吉林农业大学动物科技学院水产教研室在吉林省某虹鳟鱼场分离鉴定。胖头鱥肌肉细胞系(FHM)、大肠杆菌BL21和DH5α感受态细胞由本实验室保存。

1.2 试 剂

Trizol、TaqDNA聚合酶购于Invitrogen公司；RT-PCR相关试剂盒、cDNA反转录试剂盒、限制性内切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、250 bp DNA ladder、即用型蛋白质分子质量标准(高)，均购自Takara公司；彩色预染蛋白Ladder购自NEB公司；pGEM-T Easy、pET-32a(+)载体购自Promega公司；胶回收试剂盒、质粒DNA小量试剂盒购自爱思进公司；弗氏不完全佐剂(FICA)购自Sigma公司；HRP标记的驴抗鼠IgG购自上海生工生物工程公司。其他试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3 IHNV的扩增与G基因的RT-PCR

将IHNV CJ-13株接种到单层FHM细胞，15 ℃培养至80%细胞出现典型病变后，按照Trizol说明书提取总RNA。根据GenBank上发表的IHNVG基因序列，应用Primer Primer 5.0软件设计G基因特异性引物，上游引物增加了EcoRⅠ酶切位点GAATTC，序列为：5′-TAGAATTCATGGACGCCATGATCAC-3′；下游引物增加了XhoⅠ酶切位点CTCGAG，序列为：5′-AATCTCGAGTTAGGACCTGTTTGCC-3′。引物扩增序列长度为 1 527 bp，由上海生工生物工程公司合成。

参照RT-PCR试剂盒说明合成cDNA第1链，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：cDNA模板2 μL，上、下游引物(40 μmol/L)各1 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，ExTaq(5 U/μL) 0.5 μL，MgCl2(50 mmol/L) 1 μL，加ddH2O至25 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在-20 ℃保存，并进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4 克隆质粒pGEM-T Easy-G的构建

将PCR产物电泳后切下目的片段，按DNA胶回收试剂盒说明书回收和纯化目的DNA片段。将目的片段连接到pGEM-T Easy中，反应体系为：PCR产物0.6 μL，pGEM-T Easy 1 μL，2×Rapid ligation Buffer 5 μL，T4 DNA ligase 1 μL，去离子水补至10 μL。4 ℃连接过夜。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含0.1 mg/mL 氨苄青霉素(Amp)、0.04 mg/mL X-Gal和0.024 mg/mL IPTG的LB平板上，37 ℃过夜培养。挑取白色菌落培养后提取质粒，分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定为阳性的质粒送上海生工生物工程公司测序。将测序结果在NCBI上进行同源性比对。

1.5 表达质粒pET-32a-G的构建

分别用EcoRⅠ和XhoⅠ将序列测定正确的G蛋白基因和pET-32a(+)载体进行双酶切，酶切后用胶回收试剂盒回收产物。回收后的基因片段和pET-32a(+)载体片段用T4 DNA连接酶连接过夜，构建成pET-32a-G重组表达质粒。将重组质粒转化至BL21，涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB平板，37 ℃过夜培养。挑取单菌落培养，抽提质粒并进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，筛选阳性质粒送上海生工生物工程公司测序，将测序结果在NCBI上进行同源性比对。

1.6 重组质粒的诱导表达与表达产物的可溶性分析

将转化有pET-32a-G的BL21接种至含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min过夜培养。将菌液转种于50 mL 含0.1 mg/mL Amp的 LB培养基中，37 ℃振荡培养2 h至OD600值为0.7。加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导，分别于诱导培养的0，1，2，3，4，5，6和7 h收集菌液，进行SDS-PAGE分析[12]。

按照上述方法制备转化有pET-32a-G的菌液300 mL，转化有pET-32a(+)空载体的菌液200 mL。取转化有pET-32a(+)空载体的菌液2份各100 mL，其中100 mL加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，另外100 mL不加诱导剂，37 ℃培养4 h，收集菌液作为对照组样品。转化有pET-32a-G的菌液加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃培养4 h后离心去上清，沉淀用PBS洗涤3次，加入10 mL TE，超声破碎菌液，离心后取50 μL上清为可溶性样品；沉淀加入10 mL TE溶解，取50 μL离心，沉淀加入50 μL蒸馏水作为包涵体样品，进行SDS-PAGE分析。

1.7 抗血清的制备

取本实验室保存的IHNV细胞毒12 mL加入40%甲醛溶液30 μL，使甲醛溶液体积分数为 0.1%，37 ℃水浴48 h灭活病毒，加入12 mL弗氏不完全佐剂混匀，腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠注射0.5 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，血液离心后4 ℃过夜析出血清，此血清即为小鼠抗IHNV全病毒血清。同时，取经SDS-PAGE分离的重组G蛋白，用0.25 mol/L的KCl染色，切下目的条带加入生理盐水充分研磨，加入等体积的弗氏不完全佐剂按照上述方法免疫小鼠，制备小鼠抗G蛋白血清。试验同时设立对照组小鼠，腹腔注射同等剂量的生理盐水制备阴性血清。

1.8 G蛋白免疫原性分析

重组G蛋白经SDS-PAGE转膜后，以小鼠抗IHNV全病毒血清(稀释1 000倍)为一抗，HRP标记的驴抗鼠IgG(稀释2 000倍)为二抗，用DAB显色试剂盒显色进行Western blot 分析。用IHNV的细胞毒包被ELISA板，以小鼠抗G蛋白血清和阴性血清为一抗，HRP标记的驴抗鼠IgG为二抗，用间接ELISA试验测定抗G蛋白血清与病毒的反应性，抗G蛋白血清稀释度分别为1∶100，1∶400，1∶1 600，1∶6 400，1∶25 600。

2 结果与分析

2.1 IHNV G基因的RT-PCR扩增

RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，得到了长度约为1 527 bp的片段(图1)，与预期结果相符。

图1 IHNVG基因的RT-PCR扩增结果
M.250 bp DNA ladder;1.G基因的RT-PCR产物
Fig.1 Electrophoresis analysis ofGgene RT-PCR product
M.250 bp DNA ladder;1.Product ofGgene

图2 克隆质粒pGEM-T Easy-G的酶切鉴定结果
M.250 bp DNA ladder；1.克隆质粒pGEM-T Easy-G；2.EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的克隆质粒
Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEM-T Easy-G by double-digestion
M.250 bp DNA ladder;1.Recombinant plasmid pGEM-T Easy-G; 2.pGEM-T Easy-G digested withEcoRⅠ andXhoⅠ

2.2 克隆质粒pGEM-T Easy-G的鉴定

克隆质粒pGEM-T Easy-G用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，获得与G基因长度一致的酶切产物(图2)，与预期结果相符。克隆质粒pGEM-T Easy-G测序结果在NCBI上与IHNV其他分离株进行同源性比对，结果显示：CJ-13株G基因与ChYa07株核苷酸同源性为97.5%，氨基酸同源性为96.1%，与PcKw11株推导的氨基酸同源性为96.8%(表1)。基于G基因序列构建的系统进化树(图3)显示，CJ-13株与韩国株ChYa07和PcKw11遗传进化关系较近，处于同一分支上。

注：右上角为核苷酸序列同源性，左下角为氨基酸序列同源性。

Note:Nucleotide similarity in the top right,while amino acids similarity in the bottom left.

2.3 表达质粒pET-32a-G的鉴定

pET-32a-G质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，片段长度为1 527 bp(图4)，与预期结果相符。表达质粒pET-32a-G测序结果与2.2节相同。

图4 表达质粒pET-32a-G的酶切鉴定结果
M.250 bp DNA ladder；1.表达质粒pET-32a-G；2.EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的重组质粒
Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET-32a-G by double-digestion
M.250 bp DNA ladder;1.Recombinant plasmid pET-32a-G；2.pET-32a-G digested withEcoRⅠ andXhoⅠ

2.4 重组质粒诱导表达与表达产物的可溶性

SDS-PAGE分析结果(图5)显示，pET-32a-G重组菌经1 mmol/L IPTG、37 ℃诱导1～7 h均表达出了约76 ku的目的蛋白，与预测的理论分子质量相符；在诱导2 h左右时表达量达到最大。超声波处理诱导后菌体，经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白主要在沉淀中，以不溶性的包涵体形式存在(图6)。

2.5 IHNV重组G蛋白免疫原性分析

以重组表达的G蛋白为抗原，小鼠抗IHNV全病毒血清为一抗，HRP标记的驴抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析，结果显示，经诱导后的G蛋白能与小鼠抗IHNV全病毒血清反应，在76 ku处出现了1条明显的特异性条带，与SDS-PAGE出现的目的蛋白一致(图7)，表明表达的G蛋白能够被IHNV小鼠抗血清识别， G蛋白具有良好的反应原性。用IHNV细胞毒包被ELISA板，与小鼠抗G蛋白血清进行试验，结果显示小鼠抗G蛋白血清稀释度为1∶25 600 时，P/N( P 为加阳性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值，N为加阴性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值)值仍然大于2(表2)。这说明小鼠抗G蛋白血清与IHNV全病毒能够发生较强的反应，鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。

图6 IHNV重组G蛋白的可溶性分析
M.即用型蛋白质分子质量标准(高)；1.未诱导的pET-32a(+)空载体；2.IPTG诱导的pET-32a(+)空载体；3.IPTG诱导的pET-32a-G上清；4.IPTG诱导的pET-32a-G沉淀
Fig.6 SDS-PAGE analysis for solubility of recombinant G protein of IHNV
M.Premixed protein Marker (High);1.pET-32a(+) vector plasmid;2.pET-32a(+) vector plasmid after being induced;3.Supernatant fluid;4.Inclusion body

图7 IHNV重组G蛋白的Western blot分析结果
M.彩色预染蛋白Ladder；1.重组质粒诱导表达产物
Fig.7 Western blot analysis of expressed G protein of IHNV
M.Colorful prestained protein ladder,broad range；1.Expressed products from the recombinant plasmids

注：P为加阳性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值，N为加阴性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值, P/N>2,则判断为阳性。

Note:P means positive OD490-blank OD490,N means negative OD490-blank OD490,P/N>2 means positive.

3 讨 论

IHN是一种急性、全身性、致命的传染病，该病给全球的冷水鱼业造成了较为严重的经济损失。IHNV的主要宿主为野生、人工培育的鳟鱼和鲑鱼，自1990年在我国辽宁本溪发现第一例IHNV以来，该病的传播趋势不断扩大，对鲑鱼养殖业造成了严重的经济损失。然而，我国IHNV的研究相对比较落后，一旦爆发该病基本无法控制。因此，IHN的诊断和预防成为该病的最关键问题，研制疫苗和诊断试剂盒，从根源上切断病毒的传播是重中之重。2013年吉林农业大学动物科技学院水产教研室从吉林省延边自治州某渔场发病的虹鳟鱼苗中分离到1株IHNV，命名为CJ-13，并针对G蛋白基因构建了原核表达系统，分析G蛋白的免疫原性和反应原性。

G蛋白是编码抗原决定簇的主要蛋白，能诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫，在免疫保护机制中起着重要的作用[13]。G蛋白直接与病毒的毒力有关。有研究显示，在同属弹状病毒的狂犬病毒中，G蛋白上有多个抗原位点[14]。因此, 通常选择G基因作为抗原基因来构建DNA疫苗。Anderson等[15]构建了IHNV糖蛋白重组质粒pCMV4-G，注射虹鳟鱼苗后产生了能够中和IHNV的特异性抗体，从而使免疫接种的鱼苗得到了保护。Kurath等[16]构建了IHNV pIHNw-G DNA疫苗，免疫接种虹鳟鱼苗3个月后可100%检测出中和抗体，6个月后抗体水平逐渐下降。本试验以传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株G蛋白为研究对象，采用技术成熟、时间短、表达量高的原核表达系统构建其原核表达质粒pET-32a-G。与真核表达系统相比，原核表达系统容易纯化和易于制备抗体[17]。pET-32a(+)原核表达载体携带的硫氧还原蛋白融合标签能催化二硫键的形成，增加目标蛋白的可溶性，但本试验结果显示表达蛋白是以包涵体形式存在的。笔者试图通过降低诱导和培养温度等条件来增加可溶性蛋白未获得成功，其原因可能是表达系统中缺少某些蛋白折叠的辅助因子或者蛋白翻译速度过快导致的[18]。包涵体的存在并不影响目的蛋白所具有的抗原免疫性，不影响后续相关试验。

本试验以CJ-13株细胞毒和重组G蛋白为原料，免疫小鼠获得了鼠抗血清，经Western blot和间接ELISA试验对G蛋白的反应原性和免疫原性进行了分析，结果表明诱导产生的重组G蛋白能够与小鼠抗IHNV血清发生特异性反应，显示单一的特异性目的条带，这说明表达的重组G蛋白具有良好的反应原性。用IHNV细胞毒与小鼠抗G蛋白血清进行间接ELISA试验，结果表明小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。G蛋白既能与抗体发生中和反应，同时又能刺激小鼠产生中和抗体，这说明G蛋白反应原性和免疫原性良好，尤其是免疫原性，可以诱导机体产生免疫应答。本试验结果为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研发提供了理论基础。

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Prokaryotic expression and immunogenicity of glycoprotein gene of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) CJ-13 strain

JI Shang-lei1,ZHANG Pei-jun2,LU Yu-ting1,WANG Jian-chao1,LI Yue-hong1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2JilinCenterforHealthLaboratory,Changchun,Jilin130000,China)

【Objective】 The study cloned IHNV CJ-13 strain glycoprotein gene and constructed prokaryotic expression vector for observation of expression in hostEscherichiacolistrain BL21 to provide basis for further research and development of IHNV diagnostic kit and DNA vaccine.【Method】 The surface glycoprotein of CJ-13 isolated from rainbow trout in Changchun was amplified and cloned into pGEM-T Easy vector to construct recombinants pGEM-T Easy-G and sub cloned into prokaryotic expressing vector pET-32a(+).The pET-32a-G was transformed into theE.colistrain BL21 and the expression of G protein was induced.G protein was analyzed by SDS-PAGE,Western blot and ELISA.【Result】Ggene with the length of 1 527 bp was cloned and the expressed product was about 76 ku.The G protein was identified specifically with the mouse anti-IHNV serum by Western blot analysis.ELISA results showed that IHNV could react specifically with the serum of G protein.【Conclusion】 The prokaryotic expression of IHNV G protein was constructed successfully and the expressed G protein had immunogenic and antigenic characters as native IHNV G protein.

infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV);G protein;prokaryotic expression;immunogenicity

2014-01-17

国家自然科学基金项目(30972191)；农业部948项目(2014Z34)；长春市科技计划资助项目(2014223)

吉尚雷(1986-)，男，辽宁建昌人，硕士，主要从事动物病毒学研究。E-mail:jishanglei2008@163.com

李月红(1968-)，女，吉林长春人，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物疾病与免疫研究。

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.011

S852.65+9.5

A

1671-9387(2015)07-0001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.011.html