张松 余坤飞 熊武 袁佛良 吴淑献 潘松 周军

双特异性磷酸酶-6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用

张松 余坤飞 熊武 袁佛良 吴淑献 潘松 周军

目的探讨双特异性磷酸酶-6(DUSP-6)基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR分别检测38例鼻咽癌组织和14例慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6基因甲基化状态及其mRNA表达情况。结果 38例鼻咽癌组织中有29例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化, 14例鼻咽部慢性炎症组织中无一例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差异无统计学意义(χ2=3.217, P=0.105＞0.05), 而在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中DUSP-6基因甲基化(24/26)明显高于无淋巴结转移(5/12)的鼻咽癌组织, 差异有统计学意义(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。甲基化的鼻咽癌组织中双特异性磷酸酶-6弱或无表达, 非甲基化的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6强表达。结论 鼻咽癌中双特异性磷酸酶-6表达与其基因甲基化状态有关, 双特异性磷酸酶-6基因甲基化可能是鼻咽癌侵袭转移的重要因素。

双特异性磷酸酶-6；甲基化；鼻咽癌；转移

DNA甲基化是基因表观遗传学的主要方式, 许多肿瘤的发生发展与基因的甲基化有关, 尤其是抑癌基因启动子区高甲基化失活在恶性肿瘤的发生中起重要作用。人类双特异性磷酸酶-6(dual-specificity phosphatase-6, DUSP-6)是双特异性磷酸酶家族成员之一, 最近发现它具有肿瘤抑制作用。本研究拟应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR检测鼻咽癌组织中双特异性磷酸酶-6基因启动子区甲基化及其表达情况,了解DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 本研究中52例鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织标本来源于本院因鼻咽部新生物取活检的患者, 其中鼻咽癌组织38例, 慢性鼻咽炎组织14例。全部鼻咽癌组织经病理诊断均为未分化癌, 按照2002年国际抗癌协会TNM分期标准：Ⅰ期10 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期5例, 有淋巴结转移者26例, 无淋巴结转移者12例。所有患者在活检前均未经放疗或化疗。

1.2 甲基化特异性PCR 应用DNA提取试剂盒［Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD］提取上述组织的DNA, 然后用DNA修饰试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)对上述提取的DNA进行亚硫酸氢钠处理。根据Gene Bank中DUSP-6基因序列分别设计一对甲基化和非甲基化的扩增引物, 甲基化的引物仅能对鼻咽癌或鼻咽部慢性炎症组织中DUSP-6基因甲基化的DNA扩增出相应产物, 非甲基化的引物仅能对鼻咽癌或鼻咽部慢性炎症组织中DUSP-6基因非甲基化的DNA扩增出相应产物。DUSP-6甲基化的引物序列为：5'-ATATAATTTGTTTTAGTCGGTTCGT-3'(正义链), 5'-GATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCG-3'(反义链)；DUSP-6基因非甲基化的引物为：5'-AATATAATTTGTTTTAGTTGGTTTGT-3'(正义链), 5'-CAATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCAC-3'(反义链)。甲基化反应条件为：94℃4 min预变性, 变性94℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃30 s 35个循环, 末段延伸72℃5 min。然后将上述产物在2%琼脂糖凝胶中电泳成像分析。

1.3 RT-PCR检测DUSP-6 mRNA表达 取低温保存的上述各组织约50 mg, 用TRIzol试剂提取总RNA, 然后分别用逆转录试剂盒转录成cDNA。根据GeneBank中DUSP-6基因序列设计引物, 5'-GTGTCTTGGTACATTGCTTGGC-3'(正义链)和5'- GTCATAGGCATCGTTCATCGAC-3' (反义链), 作为内参照的β-actin的引物: 5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3' (正义链)和5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3' (反义链)。反应条件为：95℃预变性 5 min , 然后 95 ℃变性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s 35个循环, 最后末段72℃延伸5 min。反应结束后取产物5 μl用2%琼脂糖凝胶电泳并成像分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

甲基化特异性PCR结果显示, 在DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌组织中仅甲基化引物能扩增出甲基化产物, DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌组织中仅非甲基化引物能扩增出非甲基化产物。38例鼻咽癌组织中有29例DUSP-6基因甲基化, 9例为非甲基化, 其中, 临床分期I期8/10例甲基化, II期8/11例甲基化, III期9/12例甲基化, IV期4/5例甲基化。14例鼻咽部慢性炎症组织中无一例出现DUSP-6基因甲基化(Fig1)。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差异无统计学意义(χ2=3.217, P=0.105＞0.05),而在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中DUSP-6基因甲基化(24/26)明显高于无淋巴结转移(5/12)的鼻咽癌组织, 差异有统计学意义(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。

RT-PCR结果显示DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌组织中DUSP-6 mRNA弱表达或不表达, 而DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌组织中DUSP-6 mRNA强表达。

3 讨论

双特异性磷酸酶是指既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化, 也能对丝/苏氨酸残基去磷酸化的一组蛋白酶, 目前已知大部分双特异性磷酸酶都在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中行使重要生理功能。DUSP6是双特异性磷酸酶家族的一个成员, 它对MAPKs信号转导途径之一的细胞外调节蛋白激酶信号途径(extracellular-regulated kinases, ERK)有负反馈调控功能, 它的表达高低直接影响ERK信号途径的转导作用, 在人类正常组织细胞的生长、增殖、转化、迁移及各种病理状态的发生都起着非常重要的作用。最近研究发现, DUSP-6具有抑癌功能,它的高表达可抑制细胞生长、增殖、分化及促进细胞凋亡［1］。已有研究发现, 在早期肺癌和胰腺癌组织中DUSP-6高表达,而在晚期肺癌和胰腺癌组织中DUSP-6低表达, 在DUSP-6低表达的肺癌和胰腺癌细胞系中恢复DUSP-6的表达能抑制癌细胞的生长、增殖, 同时促进癌细胞凋亡。

研究发现, 肺癌中DUSP-6低表达与其基因启动子区高甲基化有关。DNA甲基化是基因表达遗传学调控的一种方式。即在DNA序列不变的情况下调节某些特定基因组区域的转录活性, 控制该基因的表达。基因启动子区CpG岛甲基化状态与基因的活性有关, 启动子区域CpG岛高甲基化是基因失活的主要原因之一, 它对基因的灭活是通过抑制该基因转录实现的。DNA甲基化在肿瘤的发生中起重要作用,以抑癌基因为代表的CpG岛高甲基化所致的基因失活已成为肿瘤表观遗传学研究的重要内容。本研究发现38例鼻咽癌组织中有29例DUSP-6基因甲基化(甲基化率为76.3%),且DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌组织中DUSP-6 mRNA弱或不表达, 而非甲基化的鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织中DUSP-6 mRNA强表达, 这说明DUSP-6的表达与其基因甲基化状态有关。另外, DUSP-6基因甲基化与鼻咽癌是否有颈部淋巴结转移有关, 这说明DUSP-6基因甲基化状态可能与鼻咽癌的转移有关。

总之, DUSP-6的表达与其基因甲基化状态有关, DUSP-6基因甲基化可能在鼻咽癌侵袭转移中起重要作用。

［1］ 张松, 李烁, 高春生.uPA基因启动子区低甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用.肿瘤防治研究, 2012, 39(6):691-693.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.31.020

2015-06-11］

深圳市科技计划项目(医疗卫生类)(项目编号：201203373)

518106 深圳市光明新区人民医院耳鼻咽喉科