岳广欣，张 玲，卢贺起，梁 媛，刘丽梅，王瑞海，张立石，王 震

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

情感失调性疾病在我国发病率达11.7%［1］，童年期虐待和缺乏关怀等早年不良经历成为引起情感失调性疾病的重要危险因素［2］。临床调查显示，儿童受虐类型、数量、严重程度、发生频度和持续时间与成人抑郁症的发生呈正相关［3］，但早年不良经历所造成的创伤从童年持续到成年的具体机制尚不清楚。中医理论认为，肝气郁滞是抑郁症的主要病机，解郁名方逍遥散治疗抑郁症得到广泛关注和深入研究［4］。近年来，用温阳补肾法治疗抑郁症的报道［5，6］逐渐增多，而早年不良经历创伤的持续存在可能与肾精受损、阳气不足有关，因此课题组运用温阳解郁法进行了治疗和预防抑郁症的研究。已发表论文显示，逍遥散加二仙汤主药及活血化痰药物对母婴分离后遭受社会击败二次应激的抑郁症模型小鼠有很好治疗疗效［7］，提示温阳解郁方可改善与抑郁症发病相关的病理机制，对早年经历所致的行为及精神异常有潜在的治疗作用。本文从该研究中关于预防实验部分的结果探讨温阳解郁法对母婴分离小鼠的作用机制，为预防早年不良经历相关的病证提供线索。

1 材料与方法

1.1 母婴分离［7］

选用大于12周的C57BL/6J雌鼠按雌雄=4∶1雌雄混居。孕鼠待产前转为单笼饲养，分娩后以小鼠出生作为0天(P0)，分别于P 1～P 10进行母婴分离，每天3 h。对照组幼鼠每天也按上述过程处理，分离时间小于10 min。

1.2 分组及处理

选用12～20周、体质量24～30 g的C57BL/6J雄性小鼠进入实验。先将经过母婴分离的小鼠分为母婴分离模型组(模型组)、温阳解郁组和氟西汀组，再将体质量及月龄相当、未经过母婴分离的小鼠作为对照组。行为学检测每组12只(决择反应实验需剔除失败小鼠，故每组少于12只)，血清皮质酮(corticosterone，CORT)检测每组20只，免疫组织化学检测每组5只。温阳解郁组和氟西汀组小鼠从实验第1天起分别灌服温阳解郁复方混悬液(5.25 g/kg)和氟西汀混悬液(20 mg/kg)，对照组和模型组小鼠灌服蒸馏水，共治疗4周。

1.3 中药及试剂

温阳解郁复方与治疗用温阳解郁方(XSF)相比减去活血化痰类药物，其方剂组成为柴胡、白芍、当归、白术、茯苓、仙茅、淫羊藿、郁金、连翘各15 g，炙甘草7.5 g，薄荷2 g。中药饮片均购自同仁堂饮片有限公司，常规煎煮水提，低温真空干燥成干浸膏并粉碎，使用时将中药浸膏粉末按比例混于蒸馏水中备用。氟西汀胶囊为礼来公司生产，地塞米松注射剂由四川迪康药业公司生产，促肾上腺素释放激素(CRH)为Sigma公司产品，小鼠CORT放射免疫检测试剂盒为美国DSL公司产品，糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)抗体(M-20)为Santa Cruz公司产品，绵羊来源11β-羟 基 类 固 醇 脱 氢 酶 2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD2)抗体为 Chemicon 公司产品，Elite ABC试剂盒及生物素化的免抗绵羊抗体均为Vector产品，行为分析软件Ethovision3.0为荷兰Noldus公司产品。

1.4 行为学检测

行为学检测均在治疗4周后开始，具体如下。

1.4.1 旷场实验 将小鼠轻轻放入旷场箱(40×40×35 cm)中央，实验在强光、白噪声下进行，观察5 min。以旷场箱中心点为中心的20 cm×20 cm为中央区，计算小鼠5 min运动总长度、中央区进入次数和中央区停留时间。

1.4.2 高架十字迷宫实验 高架十字迷宫由开放臂(30 cm×5 cm)、闭合臂(30 cm×5 cm×15 cm)和两臂汇合的中央区(5 cm×5 cm)组成，距地面50 cm。将小鼠放至两臂交汇中央，面对闭合臂，实验在暗光、白噪声下进行，观察 5 min，用Ethovision 3.0计算小鼠开放臂进入次数、开放臂停留时间、闭合臂进入次数和闭合臂停留时间。

1.4.3 趋向决择行为实验［7］采用自制的T型迷宫，对限食(2 g/d)小鼠进行食物奖赏(米粒大巧克力)训练共7 d。次日将T型迷宫干支灌入水，箱体门与干支铺板的距离为7 cm，小鼠必须费力跨过水面才能到达干支，计算小鼠反复试探并跨过水面障碍至吃掉巧克力所需的时间，如5 min结束时仍未吃掉巧克力，则计为300 s。

1.4.4 回避决择行为实验［7］将小鼠置于带电击实验装置T型迷宫(干支末端可电击)中并给予声音刺激(5 kHz 75 dB)30 s，接着0.1 mA足部电击10 s，休息120 s，每天训练10次，连续训练7 d。第8天电流升至0.5mA强化训练3次，次日进行回避决择行为检测，同趋向决择实验的方法，使干支末端箱体门与铺板的距离为7 cm。检测时给予声音刺激(5 kHz 75 dB)180 s而不给予电击，小鼠反复试探并跨过水面障碍所需的时间(Latency of Crossing Obstacle)，如180 s结束时仍未逃离箱体，则计为180 s。

1.5 血清皮质酮(CORT)检测

1.5.1 应激后CORT 将各组小鼠装入已打孔的50 ml离心管中，使小鼠处于应激状态，30 min后放出，在动物房用100 mg/kg戊巴比妥钠快速麻醉，断头取血，4℃下放置2 h，待血清明显析出后，离心(4℃，4000 g)30 min吸取上清，贮存于－20℃备测。

1.5.2 Dex/CRH实验 实验结束第2天，在各组小鼠腹腔注射地塞米松(4 μg/100 g)，6 h后再腹腔注射促肾上腺释放激素(CRH，5 μg/100 g)，30 min后快速麻醉断头取血，处理方法同上。血清CORT用放射免疫法检测，按试剂盒说明操作。

1.6 免疫组化染色

给药4周后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射将小鼠快速麻醉(100 mg/kg)，4%多聚甲醛溶液灌注后取脑，后固定12 h，30%蔗糖溶液脱水，恒冷低温切片30 μm;切片放入盛有0.01 M PBS(pH7.4)的24孔板中平衡30 min。以漂浮法进行免疫组织化学染色，将含有0.5%TritonX-100和2%正常血清的PBS稀释一抗(GR 稀释度为 1∶750，11β-HSD2为 1∶4000)，4℃孵育36 h;生物素化的二抗(1∶300)室温孵育4h，Elite ABC(1∶100，PBS稀释)室温孵育 90 min，DAB显色;以上步骤间用PBS充分漂洗，切片裱于明胶包被的载玻片上并脱水、透明、封片。选择冠状面相似的切片用Nikon E200型显微镜拍摄图像，用Imagepro Plus 5.0进行图像分析，每组选取10张切片，除杏仁体中央核(CeA)选取100 μm×100 μm 区域，余均选取 200 μm ×200 μm 进行图像分析，记录观察区域的阳性细胞数。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 行为学

表1显示，在旷场实验中，对照组和模型组比较，氟西汀组小鼠的运动总长度显著增加(P＜0.01)，温阳解郁组、氟西汀组中央区进入次数及停留时间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

在高架十字迷宫实验中，模型组进入开放臂次数明显降低，温阳解郁组进入开放臂的次数和停留时间均有所提高，但差异无统计学意义(P＞0.05)，氟西汀组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 温阳解郁复方对母婴分离小鼠旷场、高架十字迷宫行为的影响(±s)

表1 温阳解郁复方对母婴分离小鼠旷场、高架十字迷宫行为的影响(±s)

注:与对照组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组 别 例数高架十字迷宫实验5 min运动总长度(cm)中央区进入次数 中央区停留时间(s)开放臂进入次数 开放臂停留时间(s)旷场试验对 照 组 12 1068.8±291.8 8.7±3.1 16.5±8.3 6.3±3.7 16.10.9±8.0 14.5±6.7 3.0±2.6 16.0±20.2 8±11.9模 型 组 12 1148.0±221.0 9.0±3.1 15.8±8.4 4.0±2.3 16.1±16.9温阳解郁组 12 1099.5±198.7 6.7±3.2 10.4±6.5 6.0±3.8 26.2±18.5氟 西 汀 组 12 1870.0 ±685.4＊＊##

表2显示，在趋向与回避决择反应中，模型组趋向决择时间和回避决择时间较对照组明显延长，但差异无统计学意义(P＞0.05)，温阳解郁组、氟西汀组趋向决择时间显著少于模型组(P＜0.05，P＜0.01);温阳解郁组回避决择时间较对照组明显延长(P＜0.05)，氟西汀组主动回避决择时间较模型组显著降低(P＜0.01)。

表2 温阳解郁复方对母婴分离小鼠决择行为的影响(±s)

表2 温阳解郁复方对母婴分离小鼠决择行为的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01，##P＜0.01

组别 例数 趋向决择时间(s)回避决择时间(s)36.8±31.1 10 75.9±20.2 27.6±26.9模 型 组 10 103.8±54.7 62.3±54.7温阳解郁组 11 61.7±22.1# 91.3±65.1*氟 西 汀 组 10 45.3±12.1＊＊##对照组

2.2 血清CORT

表3显示，应激后各组血清CORT水平差异无统计学意义(P＞0.05);Dex/CRH实验后模型组血清CORT水平较对照组显著升高(P＜0.01)，温阳解郁组、氟西汀组均较模型组明显下降(P＜0.05)。

2.3 中枢GR的表达

表4显示，在海马CA3区各组阳性细胞均较对照组有所减少，但差异无统计学意义(P＞0.05);在齿状回(DG)，模型组GR阳性细胞数显著上升(P＜0.05)，温阳解郁组较模型组显著下降(P＜0.05)，氟西汀组较之显著抬升(P＜0.05)。在杏仁核基底外侧核(basolateral amygdale，BLA)，模型组较对照组有所下降，温阳解郁组、氟西汀组较模型组升高，其中氟西汀组比较差异有统计学意义(P＜0.01);在前额皮质(prefrontal cortex，PFC)，模型组较对照组有所升高，温阳解郁组、氟西汀组较模型组有所下降，其中氟西汀组差异有统计学意义(P＜0.01);在伏核(nucleus accumbens，NAc)，模型组表达较对照组显著减少(P＜0.05)，温阳解郁组与模型组比较差异无统计学意义，氟西汀组有所提升(P＞0.05);海马 CA1区与中央核(nucleus centralis amygdalae，CeA)变化不明显(P ＞0.05)。

表3 温阳解郁复方对母婴分离小鼠血清CORT 的影响(ng/ml，－x ± s)

表4 温阳解郁复方对母婴分离小鼠相关脑区GR的影响(±s)

表4 温阳解郁复方对母婴分离小鼠相关脑区GR的影响(±s)

注:与对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较:#P ＜0.01，##P ＜0.01

CA1 CA3 DG BLA CeA PFC NAc对 照 组 10 24.1±14.1 16.1±17.0 11.7±11.1 31.1±22.1 2组 别 例数79.0±37.8 4.4±10.8 61.3±39.6 107.3±40.6模 型 组 10 26.4±14.4 9.6± 8.9 21.8±12.6* 24.8±24.0 23.5±10.5 80.6±35.3 50.3±39.7＊＊温阳解郁组 10 29.9±10.9 7.3± 8.6 11.1±11.8# 28.6±12.5 20.2±12.5 66.1±34.6 39.2±24.9＊＊氟西汀组 10 30.7±11.8 8.2± 9.3 32.5±15.6＊＊#50.1±22.5*##23.8±11.6 45.3±30.5##

2.4 中枢11 β-HSD2的表达

表5显示，各脑区模型组的11 β-HSD2表达均明显降低，在海马CA1区、CA3区、PFC与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);温阳解郁组、氟西汀组与对照组比较，在CA3区和DG显著回升(P＜0.01)，在 NAc明显升高，但无统计学意义(P＞0.05);图1显示，在海马CA1区和PFC，2个治疗组11 β-HSD2表达较对照组显著降低(P＜0.01)，而与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，余区各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表5 温阳解郁复方和氟西汀对母婴分离小鼠11β-HSD2表达的影响(±s)

表5 温阳解郁复方和氟西汀对母婴分离小鼠11β-HSD2表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较:#P ＜0.01，##P ＜0.01

组 别 例数CA1 CA3 DG BLA CeA PFC NAc对 照 组 10 32.0±19.4 8.1±4.8 9.6±10.6 26.0±11.3 18.2 62.5±39.2± 6.8 57.7±10.3 69.1±35.3模 型 组 10 9.4±14.5＊＊ 2.0±1.2＊＊ 3.6± 2.7 16.2± 8.8 13.3± 6.4 20.1±13.9＊＊ 44.3±31.0温阳解郁组 10 11.3± 7.1* 6.2±4.3## 23.0±16.3*## 17.2± 8.3 12.4± 6.4 24.3± 7.2＊＊ 73.6±33.0氟 西 汀 组 10 4.0± 3.2＊＊▲▲ 6.2±5.7## 30.0±18.3＊＊##15.9± 9.9 14.3±11.9 22.9±12.1＊＊

图1 各组小鼠中枢海马区11β-HSD2免疫组化染色比较

3 讨论

3.1 温阳解郁法对HPA轴的负反馈调节作用

母婴分离是早年不良经历的一种常见形式，在20世纪50～60年代，大量研究发现短期的母婴分离(15 min)可以降低应激后下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴反应［8］，减少焦虑行为［9］。进入 80 年代，发现长时间重复的母婴分离恰恰得出相反的结果，出现了类抑郁表现。由于延长母婴分离可以作为抑郁易感性的动物模型进行研究，这引起了众多学者的注意。

众多研究表明，抑郁症的发病与HPA轴的异常激活有关［10］，Dex/CRH实验是预测抑郁症复发的有效方法［11］，而母婴分离可造成HPA轴活动性增加［12］，是抑郁症潜在的危险因素。HPA轴的负反馈调节发生在大脑中的高位中枢，海马、杏仁核、前额皮质(PFC)是 HPA 轴反馈抑制的重要位点［13，14］，主要通过GR和MR 2种受体进行负反馈调节。另外11 β-HSD作为糖皮质激素的代谢酶，催化具有活性的11-氧皮质类固醇，即皮质醇(啮齿类动物为皮质酮)转化为无活性的代谢皮质素，也起着调节皮质醇的作用。温阳解郁复方不但可抑制母婴分离小鼠Dex/CRH实验中CORT的高涨，还对母婴分离小鼠海马CA1区 GR表达的下降、CA3区和 DG 11 β-HSD2表达的下降均有明显上调作用。11 β-HSD2作为糖皮质激素的降解酶，其含量升高可缓冲应激引起的糖皮质激素升高对中枢神经系统的损害。GR和11 β-HSD2均可减弱 HPA 轴的激活［15］，提示温阳解郁法可改善母婴分离小鼠的HPA轴功能，从调节位点来看对海马DG区的调节作用较为突出。

3.2 温阳解郁法对行为模式的调节作用

决择行为的检测是利用生物趋利避害的本能，把巧克力作为趋向行为的奖赏，把足部电击作为回避行为的动机，从正反两个方面反映小鼠的动机水平和学习能力。在此基础上，加上需要努力才能克服的障碍(跳过水面)，以检测处于两难境地时的决择行为模式。实验中温阳解郁复方对旷场实验行为无明显影响，但可明显改善母婴分离小鼠高架十字实验中开放臂进入次数，缩短趋向决择的时间，延长回避决择的时间，提示温阳解郁复方可影响母婴分离小鼠的行为模式，促使其向趋向反应偏移，有利于动机和兴趣的恢复。PFC和NAc是决择行为相关的主要脑区，PFC与认知功能有关，NAc与动机、奖赏有关，2个脑区的功能平衡可使机体能够对外界环境做出理智的判断和选择，规范个体的行为，因此PFC的GR升高加强其对 HPA轴的抑制［16］，强化PFC对NAc的抑制作用，与焦虑/抑郁行为改善关系密切［17］。温阳解郁复方对PFC的GR表达升高有下调作用，而对11 β-HSD2在NAc的下调有显著改善作用。下调GR的表达可削弱PFC对其他相关神经核团的抑制作用，11 β-HSD2在NAc的上升，增强对GC升高的缓冲作用，强化与奖赏有关的趋向动机，缩短趋向反应的时间，提示温阳解郁复方对PFC和NAc间的平衡均有明显调整作用，从而调节个体的行为模式。

3.3 温阳解郁复方作用机理分析

幼儿时期阳气稚弱，受到刺激则阳气易于折伤，影响情感系统的发育，从而成为抑郁症发病的1个潜伏因素。根据以上理论和临床经验，课题组确定了温阳解郁法预防和治疗早年不良经历相关抑郁症，预防用药主要组成为逍遥散合二仙汤，治疗用药在此基础上加上活血化痰类药物。报道显示，逍遥散可通过神经可塑性变化而起到抗抑郁和抗应激的治疗目的［4］。二仙汤及温阳法早已应用于更年期抑郁症［18］的治疗，因此认为温阳解郁法影响母婴分离导致行为模式及HPA轴的相关变化是温阳和解郁相互配合的结果。

4 结论

温阳解郁法可明显影响母婴分离小鼠的行为模式，强化趋向反应作用;温阳解郁复方可能通过海马DG区GR和11β-HSD2的表达，调节相关脑区的神经活动，起到改善HPA轴功能的作用。

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