陈彩珍，卢 健

(1.青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室华东师范大学，上海 200241;2.华东师范大学体育与健康学院，上海 200241)

衰老过程中肌质量和力量的渐进性下降(即sarcopenia，骨骼肌衰减征)严重影响老年人的生活质量，致病率和致死率增加。研究发现，Sarcopenia的发生与骨骼肌卫星细胞的数量减少或激活能力降低密切相关［1-4］。而胰岛素样生长因子(IGF-I)是刺激卫星细胞活性和增殖、激发肌肉再塑的一个重要细胞因子，参与促进机体的生长发育、组织修复、营养代谢及细胞分化等，尤其对促进骨骼肌蛋白质的合成，减少脂肪，改善体质成分有显著的作用;生肌调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)是调节肌细胞生成最重要、最关键的调控因子，它包括MyoD(肌分化因子，Myogenic Determination)，Myf5(肌生成素5)，myogenin(肌细胞生成素)和MRF4(肌肉调节因子4)。MyoD可诱导肌卫星细胞分化成成肌细胞，myogenin则发挥着调节成肌细胞终末分化融合为肌管肌纤维的功能。运动训练可能通过激活卫星细胞并维持其增殖分化进而增加骨骼肌质量和力量，这一过程伴随着复杂的生物学调节机制，可能与骨骼肌自身分泌的多种细胞因子有关，其中IGF-1和MRFs的合成、分泌、调节对卫星细胞的激活有重要的影响。研究IGF-1和MRFs在不同运动方式中肌细胞分化和发育调控的分子生物学机制，对阐明肌肉损伤、骨骼肌萎缩或肥大的机理具有重要作用。探寻何种类型的肌肉负荷有助于肌质量的维持进而改善肌肉功能，这对延缓sarcopenia的发生发展、改善老年机体的机能亦有实质性的意义。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

6月龄SAMP8(senescence accelerated mouse/prone，快速老化小鼠)21只，购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心(实验动物饲养许可证编号:W-J津实动质M准字第006号)。随机分为3组，分别为对照组(C)、耐力训练组(E)、抗阻训练组(R)、每组7只。在IVC独立送风饲养系统中分笼饲养，每日自由饮水，喂食标准饲料，12小时光照，饲养环境温度22±2℃，湿度40-60%。

1.2 运动方案

耐力运动:8w跑台训练，参照 Siu PM训练方案［5］。抗阻运动:尾部负重爬梯训练(爬梯由本实验室设计自制，高1m，每级梯阶间隔1.5cm，倾斜85°)。训练方案参照文献［6］摸索适宜的负重重量(运动强度)，爬梯的重复次数(运动量)及每组训练的时间间隔，分别为 3Sets/day，3-4Reps/Set，间隔 20s/Rep，2min/Set。具体训练方案见表1。

表1 8周渐增强度耐力、抗阻运动训练方案

1.3 主要试剂和仪器

试剂:TRIzol Reagent，M-MLV反转录酶(Invitrogen 公司)，Goldview(上海赛百盛)，Loading bueffer(天根生化科技有限公司)，RNA酶抑制剂，Oligo dT15 primer，dNTP Mix(TaKaRa)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)。

仪器:IVC独立送风饲养系统(杭州绍丰公司)，立式高速冷冻离心机(Beckman)，Step One Real-time PCR仪(ABI)，水平/垂直电泳槽，稳压电泳仪，PCR仪(Bio-Rad)，凝胶成像系统(Alpha Innotech)，石蜡包埋机、冰冻切片机、石蜡烤片机(LEICA)。

1.4 样本的采集

末次运动后24小时，将实验鼠称重，断头处死。迅速取小鼠右侧腓肠肌，经预冷PBS缓冲液冲洗干净，称重，分为3部分(锡纸包裹)，腓肠肌中部置入新鲜配置的10%甲醛中固定备石蜡切片，剩余部分暂置液氮保存后放置-80℃超低温冰箱中待RT-PCR检测。

1.5 骨骼肌纤维横截面积的测量

腓肠肌固定后，经脱水、透明、浸蜡、包埋后常规制作厚6μm的石蜡切片，采用苏木精伊红法进行染色并拍照，Leica Qwin软件统计肌纤维横截面积、直径。

1.6 样品RNA的抽提及总RNA的质量和纯度检测

Trizol法提取样本总RNA，经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的28S、18S、5S条带，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA A260/A280＞1.8，提示总RNA完整性和质量较好。

1.7 逆转录

反应体系的总体积为 20μl，DEPC 水8μl，RNA 酶抑制剂(50U/μl)0.5μl，随机引物(50pM/ul)2μl，RNA 2μg，65℃水浴处理 5min，室温放置 10min，高速(高于5 000g)离心5s。继续加入反应物:RNA酶抑制剂(50U/μl)0.5μl，5xbuffer 4μl，dNTP MIX(1omM/each)2μl，DTT 2μl，M-MLV(200Uu/l)1μl。37℃水浴1h，90℃处理 5-10min，冰浴 5min，高速(高于 5 000g)离心 5s。

1.8 引物设计、合成及RT-PCR反应条件

通过genebank查到大鼠 IGF-1Ea、MGF、mygenin和myodmRNA序列，用Primer5.0自行设计引物序列，由上海英骏生物科技公司合成(见表2)。用β-actin作为“管家基因”(house keeping gene)，用以监控总RNA使用量，以消除不同样本间加样误差。

1.9 扩增产物检测

取PCR扩增产物15μl，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，goldenview染色，100伏电泳30分钟，在凝胶成像系统上观察，应用ImgaerTM2200分析软件进行各个样本的不同基因表达量检测。将检测基因的检测值除以GAPDH的检测值，即为该标本基因的相对表达量。

1.10 统计学分析

所有数据均以Mean±SD表示。采用SPSS统计软件SPSS11.5处理，单因素方差分析。以P＜0.05为差异显著性标准，P＜0.01为差异极显著。

表2 检测基因的引物序列及RT-PCR反应条件

2 结果

2.1 小鼠腓肠肌湿重体重比及肌纤维横截面积检测

由表3、图1可见，抗阻训练组腓肠肌湿重/体重比值(RM)极显著高于对照组和耐力训练组(P＜0.01)。与对照组比较，抗阻训练组小鼠腓肠肌肌纤维横截面积有显著增大(P＜0.05)，而耐力训练组与对照组比较无显著性差异;抗阻训练组腓肠肌肌纤维横截面积亦显著高于耐力训练组(P＜0.05)。

表3 小鼠腓肠肌肌湿重体重比(RM)及肌纤维横截面积(CSA)

图1 各组小鼠腓肠肌纤维横截面积照片(×40)

2.2 运动对小鼠腓肠肌IGF-I、MGF和成肌调节因子mRNA表达的影响

耐力训练和抗阻训练后，小鼠腓肠肌IGF-ImRNA表达均升高，与对照组相比有显著性差异(分别P＜0.05，P＜0.01)，两运动组间未发现明显差异(P=0.086)，但抗阻训练组IGF-ImRNA表达有增加的趋势。

耐力训练和抗阻训练后，小鼠腓肠肌MGFmRNA表达均显著升高，与对照组相比有显著性差异(分别P＜0.05，P＜0.01)。两训练组之间比较，抗阻训练组腓肠肌MGFmRNA表达极显著耐力训练组(P＜0.01)。

表4 小鼠腓肠肌IGF-I、MGF mRNA的表达

小鼠腓肠肌MyoDmRNA及myogenin mRNA表达趋势相似，即与对照组相比，耐力训练组和抗阻训练组均显著性升高(分别P＜0.05，P＜0.01);两运动组之间比较却未发现显著性升高，但抗阻运动组有增加的趋势(见表5)。

表5 小鼠腓肠肌MyoD、myogenin mRNA的表达

3 讨论

sarcopenia是衰老过程中出现的肌肉质量和力量下降的退行性变化，严重影响老年人的生活质量，也是一些慢性疾病的诱发原因。但改善肌肉质量一直得不到重视。大量的研究认为，运动仍然是保持肌肉整体机能最有效的方法［6］。运动引起骨骼肌肥大的机制已有近百年的研究历史，并且一直是备受运动医学界关注的热点课题。

骨骼肌纤维是一种终末分化的细胞类型，主要由成肌细胞分化而来。骨骼肌卫星细胞存在于肌膜和基膜之间。正常情况下，卫星细胞处于休眠状态，当肌肉受到损伤刺激时，卫星细胞被激活、增殖、变成纺锤形的成肌细胞，继而融合成肌管，形成新的肌纤维［7］。在骨骼肌生长发育过程中，肌卫星细胞的激活、增殖与分化等复杂的生理过程受多种激素和生长因子的调控。如IGF-I、MRFs等。骨骼肌IGF-I有3种亚型:IGF-IEa、IGF-IEb、IGF-IEc。IGF-IEc 也称机械生长因子(mechano growth factor，MGF)，它具启动肌卫星细胞增殖、抑制分化、促进骨骼肌损伤修复等功能，作用于骨骼肌肥大的初始阶段［8］。IGF-IEa主要表现为刺激成肌细胞的融合和肌纤维的增大，即作用于骨骼肌肥大的后程阶段［9］。

MRFs也称为MyoD家族，是在骨骼肌胚胎发育过程中发现的一组转录调节因子。研究显示，MyoD家族成员都参与成肌细胞向肌细胞的分化过程，对于维持体内肌肉的生成起关键作用。其中，MyoD对肌细胞分化的启动、多种细胞向成肌细胞转化中发挥重要作用［10］。myogenin是肌细胞终末分化的关键因素，调节成肌细胞终末分化融合为肌管肌纤维。

年龄相关的Sarcopenia以I、II型肌纤维丢失，尤以II型肌纤维横截面积下降为主，该现象能被机械负荷所阻断，机械负荷能增大肌纤维横截面积，但不能恢复肌纤维数量至年轻时的水平［11］。目前关键要考虑哪种形式的肌肉负荷对老年个体保存肌肉质量、延缓Sarcopenia的进程最有效。抗阻训练是完全依靠自身力量克服一定外界阻力的运动，是唯一能显著提高肌肉质量的运动方式。有氧运动训练能增强肌肉耐力水平，明显有利于心血管健康，但它并不能有效增加肌质量和力量［12-13］。不同运动方式可能对卫星细胞的激活、骨骼肌肥大产生不同程度的影响［14-17］。

本研究中主要通过检测卫星细胞激活、骨骼肌肥大过程中的几个关键细胞因子的基因表达，比较耐力训练和抗阻训练对骨骼肌卫星细胞增殖分化能力的作用及可能机制。结果发现不管是耐力训练还是抗阻训练均能显著上调腓肠肌IGF-1、MGF、MyoD及 myogenin等mRNA的表达，尤其是抗阻训练组变化幅度更大，升高更显著。但是在观察腓肠肌横截面积时，却发现8周的耐力训练并不能有效增大腓肠肌横截面积，而抗阻训练这一指标得到显著提高，提示这两种形式的运动均能在基因转录水平影响IGF-1两个亚型及MyoD家族两个成员的表达。但由于抗阻运动是肌肉克服施加其上的阻力产生收缩的运动方式，其对肌肉本身的影响更直接，更有助于刺激肌肉肥大，提高肌肉力量;而耐力训练对骨骼肌的刺激相对温和些，对肌卫星细胞增殖分化的影响程度也相对弱些，最终表现为肌质量的有限改善。根据MGFmRNA在两种不同训练方式中的表达差异可清楚看到，本研究采取的负重爬梯抗阻训练可显著上调MGFmRNA的表达，与耐力训练组比较有显著差异。MGF，也称为力生长因子或机械生长因子，它对力刺激特别敏感。动物实验证明，理论上大鼠可以负重350%-400%自身体重;如负荷低于200%，不足以有效诱发骨骼肌肥大［18-19］。而本实验所用小鼠为6月龄SAMP8快速老化鼠，处于中老年阶段，根据这些小鼠的具体情况，实验中对其负荷量进行适当调整，即在8周训练中负荷逐渐加大，直至100%体重。运动中，肌肉组织应答过载的机械压力时MGF基因表达特别敏感，而且先于IGF-I和IGFIEa的表达［20］。在负重爬梯训练时不仅具有过载的负荷，还可产生机械性应答刺激促进MGFmRNA的表达，而耐力训练在这两方面的作用效果并不明显［21］。本研究结果同时也提示耐力训练和抗阻训练在激活肌卫星细胞的内在机制上的区别，可能涉及不同的信号转导通路，或相关基因表达调控的不同水平。由于本研究仅针对肌卫星细胞增殖分化相关因子的转录水平进行了观察，故尚不能明晰耐力训练和抗阻训练在影响肌质量方面差异的真正原因。

综上分析，在骨骼肌对运动训练的适应过程中牵涉到众多物质的量或活性的相应变化，虽然IGF-1或MRFs在骨骼肌对运动训练尤其是抗阻训练的肥大适应中均发挥了重要作用，但它们对机械负荷的应答方式不尽相同，它们的时空表达具有特异性，彼此之间有较大差异，故还需要从多角度、多层次、多手段深入研究。

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