叶下珠水提物对裸鼠人肝癌移植瘤HBx和VEGFR3表达的影响

2014-11-08魏春山唐海鸿王宏艳邢宇锋童光东周大桥

安徽中医药大学学报 2014年4期

魏春山，唐海鸿，王宏艳，邢宇锋，童光东，周大桥

（1.深圳市中医院肝病科，广东深圳 518033；2.华中科技大学同济医学院感染科，湖北武汉 430074）

目前认为，乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus x gene，HBx）对于乙型肝炎相关肝癌的形成和进展起到关键作用，而肿瘤的生长和转移赖以血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptors，VEGFRs），其中VEGFR3主要作用于淋巴通路［1］，其与HBx是否存在相互作用及其机制尚不得而知。本研究通过复制转染HBx基因、VEGFR3基因和氯霉素乙酞转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）基因的肝癌皮下移植瘤模型，并用中药叶下珠水提物（the aqueous extract ofphyllanthusurinariaL.，AEP）进行干预，拟探讨HBx和VEGFR3在乙型肝炎相关肝癌中的作用。

1 材料

稳定人肝癌细胞株 HepG2－HBx，HepG2－CAT，HepG2－VEGFR3，由本课题组前期通过逆转录病毒转染法构建，液氮冻存于本院中心实验室。AEP，由本课题组采用乙醇水提取法制备［2］。环磷酰胺（cyclophosphamide，Cytoxan，CTX）针剂（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字号为H32020857，批号 11031921）。裸鼠（Balb／c－nu 裸小鼠）60只，购自南方医科大学实验动物中心（实验动物生产合格证号：SCXK（粤）2006－0015；编号：0083740），4周龄，雄性，体质量10.87～17.21g。VEGFR3兔多抗、HBx单抗（Abcam）等，购自广州英韦创津生物科技有限公司，按试剂盒说明书操作。其他实验材料由广州中医药大学基础医学院分子免疫研究所提供。

2 方法

2.1 细胞制备［3］将液氮冻存细胞HepG2－HBx，HepG2－CAT，HepG2－VEGFR3分别按常规复苏、传代、扩增，检测细胞活力，调细胞浓度至1.0×107／ml。

2.2 动物管理裸鼠（实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2008－0001）在3种肝癌细胞扩增完成前1周购买，立即进行编号、称体质量、分装，饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF实验室（编号0058667），25℃室内饲养，以适应环境，每周称体质量1次。

2.3 动物分组通过SPSS 17.0随机数字法，对动物进行随机分组，每组6只，共10组（G1—G10），常规饲养1周后复制肝癌移植瘤模型，模型复制成功后按照分组分别进行药物干预（见表1）。

表1 接种不同肝癌细胞的裸鼠分组及药物处理因素

2.4 模型复制方法收集1.0×107／ml的目的细胞悬液，外包装灭菌后送入实验动物中心。模型复制前称量裸鼠体质量。G1组每只颈背部皮下注射0.2ml生理盐水。G2—G10组每只颈背部皮下分别注射1.0×107／ml轻轻摇匀的目的细胞0.2ml。注射后可见注射部位一圆形或椭圆形粟米大小皮丘状突起，局部皮肤发白。

2.5 给药剂量和方法 AEP口服给药剂量为14.25 g／kg（相当于成人剂量的12.5～18.0倍），采用灌胃法，每周6次。CTX给药剂量（注射剂量）为每只小鼠46.57mg／kg（相当于成人临床用量的20倍）。NS用法：与AEP等容积灌胃，按每只小鼠46.57 mg／kg腹腔注射CTX，每周5次。按CTX使用疗程，共使用30次（1个疗程），疗程结束时采集标本。

2.6 取材疗程结束时称量裸鼠体质量，常规摘除眼球取血，颈椎脱臼法处死，取肿瘤、肝脏等新鲜组织。

2.7 观察指标及检测分别观察实验动物体质量；瘤体质量、形态等；酶联免疫吸附法测定血清甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）水平；Western blot检测瘤组织HBx、VEGFR3蛋白表达。

2.8 统计学方法运用SPSS 17.0进行统计学分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。因素内和（或）因素间均数差异比较，采用单因素方差分析、两因素析因设计的方差分析或重复测量设计的方差分析，均数多重比较采用LSD法。显著性水准：α＝0.05。

3 结果

3.1 各组裸鼠移植瘤复制情况模型复制后第7天，接种3种肝癌细胞的各组裸鼠瘤体直径已达0.5～0.8cm，质感稍韧，可在皮下移动，视为模型复制成功，模型复制成功率为100%。见图1。

图1 裸鼠移植瘤模型（示颈背部皮下移植瘤）

3.2 各组裸鼠体质量变化比较裸鼠体质量均随时间增长，经重复测量数据的方差分析，结果显示不同观察时间的体质量差异均具有统计学意义（P＜0.05）。且不同观察时间与各分组之间也存在交互作用（P＜0.05），在接种肝癌细胞后第8周，G1组裸鼠体质量显著高于 G2、G4、G5、G7、G8、G10组（P＜0.05，或P＜0.01）。见图2。

3.3 接种不同肝癌细胞和接受不同处理因素的裸鼠移植瘤质量比较经两因素析因设计的方差分析，各组总体方差齐（P＝0.495）。组间分析结果显示，接种细胞因素对肿瘤质量差异的主效应无统计学意义（P＝0.169）；而处理因素（NS、CTX 及AEP）间及处理因素与接种细胞间的交互作用均有统计学意义（P＜0.05，或P＜0.01）。进一步将处理因素的主效应进行多重比较，结果提示两治疗组（CTX组与AEP组）与对照组（NS组）肿瘤质量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），但AEP组与CTX组之间肿瘤质量差异无统计学意义（P＞0.05）。

按接种细胞进行分层，对处理因素的效应进行多重检验，结果显示，相同接种细胞组内，CTX组和AEP组与NS组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；接种 HepG2－HBx细胞各组中，AEP组（G4）肿瘤生长最慢，且与CTX组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示AEP有更好的抑制HBx相关肿瘤生长的作用；而接种 HepG2－CAT细胞与HepG2－VEGFR3细胞的各组中，AEP组和CTX组肿瘤质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图2 接种肝癌细胞后不同时间各组裸鼠体质量比较（n＝6）

表2 接种不同肝癌细胞和接受不同处理因素的裸鼠移植瘤质量比较（±s）

注：与接种同一肝癌细胞、接受NS处理组比较，＊P＜0.05；与接种同一肝癌细胞、接受CTX处理组比较，△P＜0.05。

HepG2－HBx NS G2 6 3.17±0.35 CTX G3 6 2.23±0.29＊AEP G4 6 1.60±0.37＊△HepG2－CAT NS G5 6 2.87±0.19 CTX G6 6 1.82±0.19＊AEP G7 6 1.89±0.26＊HepG2－VEGFR3 NS G8 6 3.04±0.22 CTX G9 6 2.00±0.31＊AEP G10 6 2.08±0.39＊

3.4 各组裸鼠血清AFP水平比较两因素析因设计的方差分析结果显示，各组总体方差齐（P＞0.05）。接种细胞因素与处理因素的主效应差异均无统计学意义（P＞0.05）；而处理因素与接种细胞间的交互作用有统计学意义（P＜0.05）。按接种细胞进行分层，对处理因素的效应进行多重比较，结果显示，接种 HepG2－HBx细胞的各组中，NS组与CTX组、AEP组AFP水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组裸鼠血清AFP水平比较（±s）

注：与接种 HepG2－HBx细胞、接受NS处理组比较，＊P＜0.05。

NS G1 6 3.08±1.59 HepG2－HBx NS G2 6 2.90±2.35 CTX G3 6 4.90±1.26＊AEP G4 6 4.38±2.55＊HepG2－CAT NS G5 6 5.00±1.51 CTX G6 6 2.70±1.23 AEP G7 6 2.83±1.92 HepG2－VEGFR3 NS G8 6 2.62±1.80 CTX G9 6 3.78±1.02 AEP G10 6 2.73±1.91

3.5 接种HepG2－HBx肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织HBx表达水平单因素方差分析及事后多重比较结果显示，AEP组与CTX组移植瘤组织中HBx表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与NS组比较，AEP组和CTX组移植瘤组织中HBx表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果表明AEP和CTX均具有显著抑制移植瘤组织中HBx表达的作用。见图3和表4。

图3 接种HepG2－HBx肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织HBx表达水平（Western Blot法）

表4 接种HepG2－HBx肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织HBx表达水平比较（±s）

注：与NS组比较，＊P＜0.05。

NS G2 6 0.036 7±0.004 5 CTX G3 6 0.032 3±0.003 1＊AEP G4 6 0.032 0±0.001 9＊

3.6 接种不同肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平比较两因素析因设计的方差分析结果显示，各组总体方差齐（P＞0.05）。接种细胞因素及处理因素的主效应差异均有统计学意义（P＜0.01）；而处理因素与接种细胞间的交互作用无统计学意义（P＞0.05）。且接种细胞较处理因素对总变异的贡献更大（0.785vs0.465）。

按接种细胞进行分层，对处理因素的效应进行多重比较，结果显示，接种相同肝癌细胞的各组中，AEP组VEGFR3表达水平最低，但与CTX组表达水平比较，差异无统计学差异（P＞0.05）；AEP组和CTX组VEGFR3表达水平显著低于NS组（P＜0.05）。结果表明AEP具有较好的抑制肝癌细胞中VEGFR3表达的作用。

按处理因素进行分层，对接种细胞的效应进行多重比较，结果显示，对于相同的处理因素，接种HepG－VEGFR3细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平最高，接种HepG－CAT细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平最低，接种HepG－HBx细胞和HepG－CAT细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平均显著低于接种HepGVEGFR3细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平（P＜0.01）。提示HBx蛋白可能具有上调肝癌细胞中VEGFR3表达的作用，AEP可抑制接种3种肝癌细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3的表达，AEP抑制肝癌移植瘤组织中VEGFR3表达的作用与HBx蛋白的表达具有一定关联。见图4和表5。

图4 接种不同肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平（Western Blot法）

表5 接种不同肝癌细胞的各组裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平比较（±s）

注：与接种相同细胞、接受NS处理组比较，＊P＜0.05。

接种细胞处理因素组别n VEGFR3相对表达水平HepG2－HBx NS G2 6 0.130 3±0.017 4 CTX G3 6 0.112 5±0.014 1＊AEP G4 6 0.106 7±0.010 3＊HepG2－CAT NS G5 6 0.119 7±0.009 2 CTX G6 6 0.101 3±0.010 5＊AEP G7 6 0.093 7±0.006 6＊HepG2－VEGFR3 NS G8 6 0.161 7±0.011 5 CTX G9 6 0.147 7±0.010 6＊AEP G10 6 0.143 7±0.006 6＊

4 讨论

肿瘤血管和淋巴管生成是肿瘤转移过程中的重要条件，VEGF及各VEGFR发挥着各自不同的作用［4］，其中VEGFR3参与促进新生血管的生长，特别是肿瘤淋巴管的生长和发育，对肿瘤的生长和转移起着独特的作用［1］。而在乙型肝炎患者肿瘤形成过程中，HBx蛋白是一种多功能的调节蛋白，具有广泛的反式激活功能，在肝癌的发生、发展到侵袭转移中发挥着不可忽视的作用［5］，两者是否对肝癌的生长和转移具有协同作用尚不明确［6］。

叶下珠（PhyllanthusurinariaL）为大戟科叶下珠属植物，含有生物碱类、多酚类等多种成分［7］，全草入药，具有抗乙型肝炎病毒和抗肿瘤等作用［8］。目前从叶下珠中分离出没食子酸、鞣花酸等多种化合物，其中多酚和可水解鞣质为叶下珠的主要活性成分，没食子酸的含量最高，没食子酸是可水解鞣质的单体，具有抗病毒、抗肿瘤［2，5］、抗血管生成［9］等作用，还有直接抗病毒作用［10］。而在目前研究中，尚无叶下珠对肝癌VEGFR3表达作用的相关报道。

此前，笔者以扶正祛邪为纲，拟定了复方叶下珠作为防治肝癌的协定方，并主要用于治疗肝癌及癌前病变［11］，以及 HBxAg致肝癌的研究，证实复方叶下株可通过抑制HBxAg表达发挥抗肿瘤效应［12］，阻止肝癌前病灶生长及肝癌的形成［13］，但两者机制并不明确。在对叶下珠单体的研究中，进一步发现两种新的乙酰化黄酮苷化合物，可能发挥主要药用价值［14］。

本研究中，各组动物体质量均随时间增长，实验结束时，接种HepG2－HBx细胞的各组中，AEP组（G4）肿瘤质量及HBx表达水平均较CTX组更低，也与前期结果一致［12］。按处理因素进行分层，对接种细胞因素的效应进行多重比较，结果显示，在接受NS处理的各移植瘤模型中，接种HepG2－HBx细胞和HepG2－VEGFR3细胞的裸鼠移植瘤组织中VEGFR3表达水平均显著高于接种HepG2－CAT细胞组（P＜0.05），表明VEGFR3在接种 HepG2－HBx细胞和 HepG2－VEGFR3细胞的Balb／c裸鼠皮下移植瘤组织中均有较强表达，HBx可能上调肝癌细胞中VEGFR3表达水平。按接种细胞因素进行分层，对于接种相同肝癌细胞的各组裸鼠，AEP处理组VEGFR3表达水平均显著低于NS和CTX处理组，表明AEP具有较好的抑制肝癌细胞VEGFR3表达水平的作用。

综上所述，AEP不仅对肝癌移植瘤中HBx表达具有直接抑制作用，同时也直接抑制肝癌移植瘤中VEGFR3蛋白表达，并可能通过抑制HBx蛋白表达间接抑制VEGFR3蛋白表达，实现对乙型肝炎相关性肝癌的抑制作用。同时，AEP对HBx阴性肝癌的抑制作用，可能也是通过VEGFR3途径得以实现的。由于乙型肝炎相关肝癌的机制尚未完全明了，其携带HBx或VEGF及相关VEGFR的水平可能也与外源性转染基因存在较大差异，因此，对其相关性尚有待进一步探讨和确认。

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