王 艳，谢道俊，鲍远程，张 娟，储丹晨，韦 彪，孙愘叡，丁伟军，鲍婷婷，王秋烨，赵志勇

（1.安徽省亳州市华佗中医院脑病科，安徽 亳州 236800；2.安徽中医药大学第一附属医院脑病科，安徽 合肥 230031；3.安徽省六安市中医院脑病科，安徽 六安 237006）

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是指由缺血性卒中、出血性卒中等脑血管疾病导致的严重认知功能障碍综合征［1］。随着脑血管疾病发病率的提高，VaD的发病率也在迅速增加，近来有研究人员采用整体抽样方法调查了上海市、黑龙江省、山西省和广东省的城乡社区60岁以上老年人，老年痴呆症的患病率为5.2%［2］。VaD的主要表现有两大方面：认知功能障碍和相关脑血管病区的神经功能障碍。VaD的临床分类包括多梗死性痴呆、关键部位梗死性痴呆、皮质下血管性痴呆和小血管性痴呆［3］。VaD不同于阿尔滋海默病，它是目前唯一可以防治的痴呆。本研究采用双侧颈总动脉永久性结扎法复制VaD大鼠模型，并采用黄蒲通窍胶囊进行治疗，以观察其对VaD大鼠行为学表现和海马CA1区病理变化的影响。

1 材料

1.1 实验动物 雄性健康Wistar大鼠90只，8周龄，清洁级，体质量200～230g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号为SCXK（沪）2012－0002，适应性喂养2周。

1.2 药物 多奈哌齐：卫材（中国）药业有限公司生产，批号为国药准字H20050978；黄蒲通窍胶囊（由人参、大黄、石菖蒲、益智仁、川芎、郁金等组成）：安徽中医药大学第一附属医院药剂科制备，批准文号为皖药制字Z20080006，生产批号为20120618。

1.3 仪器 Morris水迷宫及相关动物行为学实验视频分析系统：安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司。

2 方法

2.1 模型复制 采用永久性结扎双侧颈总动脉法［4］复制VaD大鼠模型。大鼠术前12h禁食，自由饮水。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠仰卧，固定于自制的大鼠手术操作木板上，颈部皮肤剪毛备皮，碘伏常规无菌操作，酒精棉球脱碘。切口位于颈正中线处，长约1cm，钝性分离皮下组织后，于切口正下方的斜方肌与气管夹角处可见左侧颈总动脉搏动，分离出左侧颈总动脉后，以4号丝线远近端双重结扎，从中剪断。右侧操作方法与左侧相同。术中动作轻柔，避免钳夹和过分牵拉迷走神经，注意无菌原则，行逐层间断缝合术，术后放入保温的鼠笼（电热毯保温），待大鼠清醒后，放回动物笼架上单笼饲养，予自由进食进水，术后连续5d每天以碘酒擦洗伤口及周围皮肤。假手术对照组大鼠的双侧颈总动脉不结扎，其余与模型组操作方法一致。

2.2 实验分组与处理 将大鼠适应性喂养2周后，随机分为5组，即模型组、多奈哌齐组及黄蒲通窍组，各22只，假手术组及正常对照组各12只。术后24h各组予相应药物灌胃：正常组、假手术组及模型组：给予生理盐水灌胃（每日5.0ml／kg）；多奈哌齐组：每日给予多奈哌齐溶液0.63mg／kg；黄蒲通窍组：每日给予黄蒲通窍溶液1.51g／kg，连续灌胃45d后，进行Morris水迷宫试验，观察脑组织病理变化。

2.3 行为学检测 Morris水迷宫主要用于测试动物对空间位置觉和方向觉（空间定位）的学习记忆能力，是检测动物记忆能力的重要工具［5］。Morris水迷宫可同步记录大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数、目标象限次数、目标象限距离等相关数据。本研究从术后第40天开始Morris水迷宫试验，设置最大潜伏时间为180s，实验分为两部分［6］。①定位航行实验：用于训练和测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验历时5d。第1天，水中不放平台，上午将大鼠放入水中适应游泳环境3min，最后将大鼠引至平台上；下午记录动物游泳3min的轨迹，作为对照数据（图1第1天下午数据）。从第2天开始，选一个象限放置平台，每天分上午、下午分别从4个象限各选一个入水点，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，计算机自动记录大鼠从入水开始至寻找到平台所需的时间，即为逃避潜伏期。从一个入水点放入水中至大鼠找到平台为一个训练程序；如果大鼠3min内未找到平台，将其引至平台，并停留40s，逃避潜伏期记为3min，每次训练间隔为1min，上午、下午各训练4个程序。②空间搜索实验：第6天，拆除平台，然后选择平台所在的对角象限将大鼠面向池壁放入水中，系统自动记录：3min内大鼠从对角象限跨跃原平台的次数（简称“跨越平台次数”）及跨越平台所在象限的次数（简称“目标象限次数”），3min内游泳距离及其占游泳总距离的百分比（简称“目标象限距离”）。

2.4 病理学检测 水迷宫实验后，将大鼠断头处死，在冰块上取大鼠海马，用4%多聚甲醛灌注固定后，取海马CA1区包埋，连续冠状切片，片厚5μm，用苏木精－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色，观察海马CA1的病理变化。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。同组大鼠逃避潜伏期比较，采用重复测量资料的方差分析；各组跨越平台次数、目标象限次数、目标象限距离比较，采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 双侧颈总动脉同时结扎术后，大鼠总体表现出活动减少，稍有烦躁，摄食及饮水不积极，其中单睑下垂50只，双睑下垂20只，单睑出血21只，双睑出血15只，这些情况多在48h内恢复正常，其中2只大鼠出现永久性偏瘫，4只手术后出现癫痫发作（极度烦躁、抽搐等）并于24h内死亡，3只出现声音嘶哑，1只出现饮水呛咳。在随后实验过程中，2只大鼠出现伤口脓包，予以切开排脓处理，灌胃过程中死亡2只，不明原因死亡3只。结果共死亡37只（手术过程中死亡4只、术后24h死亡16只，术后24h至1周死亡10只，1周至行为学检测期间死亡7只），矿场实验排除焦虑、抑郁症大鼠2只，排除永久性偏瘫大鼠2只，结果共剩余49只大鼠完成本实验（正常对照组、假手术组、模型组各9只，黄蒲通窍组12只，多奈哌齐组10只）。

3.2 Morris水迷宫结果比较

3.2.1 定位航行试验结果比较：从第2天开始，与正常对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长（P＜0.01）；各组逃避潜伏期随着训练程序的增加而降低，至第4天和第5天趋于平稳，此时黄蒲通窍组和多奈哌齐组大鼠逃避潜伏期均较模型组显著缩短（P＜0.01），但仍显著高于对照组及假手术组（P＜0.05）；多奈哌齐组和黄蒲通窍组大鼠逃避潜伏期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1。

3.2.2 各组空间探索试验结果比较：假手术组与正常对照组大鼠跨越平台次数、目标象限次数及目标象限距离比较，差异无统计学意义（P＜0.01）；模型组上述3个指标均较假手术组显著降低（P＜0.01）；黄蒲通窍组和多奈哌齐组上述3个指标均较模型组显著升高（P＜0.01）；黄蒲通窍组与多奈哌齐组上述3个指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

3.3 各组大鼠海马CA1区病理变化比较 正常组和假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞多而排列紧密、均匀、整齐，层次清晰，胞体完整，胞浆丰富，胞核大而圆，核膜完整，核仁清晰，染色均匀。模型组大鼠海马CA1区神经细胞数量减少，大部分神经细胞皱缩，排列紊乱，胞体形态各异，胞核着色较深，呈嗜酸性变，核固缩，核仁消失，胞浆周围出现空晕，少数神经细胞明显肿胀，神经细胞、神经胶质细胞与周围的间隙明显增宽。黄蒲通窍组大鼠海马CA1区正常神经细胞数量较多，排列较密，层次较清晰，神经细胞结构较完整，胞核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，染色质丰富，少数神经细胞变性、萎缩、染色较深，神经细胞周围的间隙较模型组稍有增宽。多奈哌齐组大鼠海马CA1区组织形态学变化与黄蒲通窍组类似。见图2。

图1 各组大鼠不同时间逃避潜伏期比较

表1 各组大鼠空间探索实验结果比较（±s）

表1 各组大鼠空间探索实验结果比较（±s）

注：与假手术组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

正常对照9 9.01±1.23 12.90±2.57 83.42±9.85假手术 9 8.59±1.67 11.64±2.70 83.41±8.20模 型 9 3.82±2.22＊＊ 5.57±1.13＊＊24.31±4.09＊＊多奈哌齐 10 6.98±1.13＃＃12.42±3.69＃＃77.23±8.23＃＃黄蒲通窍 12 6.30±0.78＃＃11.20±2.86＃＃76.75±7.36＃＃

图2 各组大鼠海马CA1区组织形态学变化比较（HE染色，10×40倍）

4 讨论

目前，VaD模型的复制方法很多，双侧颈总动脉结扎法操作简单，应用广泛，很好地模拟了VaD慢性低灌注这一病理过程。双侧颈总动脉结扎法可导致海马CA1区缺血。实验结果表明，VaD模型海马CA1区神经细胞凋亡、坏死严重，而黄蒲通窍组和多奈哌剂组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡、坏死明显减轻。结果提示，VaD大鼠模型可很好地模拟慢性脑缺血致认知障碍的病理改变，是观察慢性低灌注导致脑白质损害的有效工具；黄蒲通窍胶囊和多奈哌齐可以拮抗VaD大鼠认知功能相关脑区的病理变化。本研究中，动物模型的复制成功率较低（约为54.44%），大鼠死亡原因主要有4个方面。①双侧颈总动脉结扎后，出现急性脑缺血水肿，诱发癫痫。②手术切口虽然小，但术中因要剥离颈总动脉，牵拉损伤迷走神经导致生命节律变化。③因给药时间达45d，每天灌胃，可能损伤大鼠食管胃黏膜。④因术前24h禁食，加之手术应激，有的大鼠可能术中出现低血糖、肺部感染、昏迷等。

Morris水迷宫广泛应用于研究空间学习记忆机制，是最常用的动物神经行为学检测项目。经Morris水迷宫训练后形成的记忆是一种空间参考记忆，其储存与提取涉及边缘系统、基底前脑、纹状体、小脑和其他相关区域，其记忆过程属于陈述性记忆，而临床上痴呆患者大多是陈述性记忆首先受损。所以，从检测的记忆属性来看，Morris水迷宫试验可以用于筛选VaD的有效防治药物［7－9］。VaD临床病机特点以正虚为主，兼有虚实夹杂，单纯实证较少见，证型有肾虚髓亏、肝肾阴虚、痰蒙清窍、瘀阻清窍、心肝火旺、心脾两虚、气虚血瘀等。黄蒲通窍胶囊是本课题组基于多年临床实践总结出来的治疗VaD的院内制剂，具有益气补肾、豁痰开窍、活血通络的功效。前期研究［10－11］表明，黄蒲通窍胶囊能够上调脑缺血后脑组织c－fos表达水平，下调脑组织核因子－κB表达水平，保护脑组织，抑制神经细胞凋亡，通过Fas信号通路抑制神经细胞凋亡而起到改善记忆和认知功能的作用。临床研究［13－14］发现，黄蒲通窍胶囊可明显改善VaD患者智能积分，提高VaD患者的血清生长抑素、精氨酸加压素水平，降低血清一氧化氮、一氧化氮合酶的含量。本研究发现，术后45d，黄蒲通窍胶囊可以显著拮抗VaD模型大鼠空间学习记忆能力的下降。

综上所述，双侧颈总动脉永久性结扎可引起模型大鼠学习记忆能力下降和海马CA1区神经细胞损伤，黄蒲通窍胶囊能够改善模型大鼠学习记忆能力，并且能明显改善大鼠海马CA1区的病理变化。

［1］贾建平.神经病学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：205－208.

［2］贾伟华，马颖，陈若陵，等.中国部分城乡社区老年痴呆症患病率及其影响因素研究［J］.安徽医科大学学报，2012，47（8）：944－947.

［3］吴江.神经病学［M］.北京：人民卫生出版社，2010：190－193.

［4］查运红，梅元武，黄敬.老年期痴呆大鼠模型的制备及其神经行为学研究［J］.中华物理医学与康复杂志，2005，27（11）：641－644.

［5］闫盼盼，闫国立，詹向，等.Morris水迷宫实验设计的统计学方法探析［J］.中华中医药学刊，2013，23（2）：264－266.

［6］马原野.王建华认知神经科学原理和方法［M］.重庆：重庆出版社，2002：250－253.

［7］方松.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：321－326.

［8］Howard Eichenbaum.记忆的认知神经科学：导论［M］.周仁来，郭秀艳，叶茂林，等，译.北京：北京师范大学出版社，2008.123－125.

［9］吕国蔚，李云庆.神经生物学实验原理与技术［M］.北京：科学出版社，2011，340－345.

［10］李之和，谢道俊，江停战，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠神经细胞核因子－κB的影响［J］.中国临床保健杂志，2005，8（6）：240－242.

［11］刘妮，谢道俊，曹仕健，等.黄蒲通窍胶囊对拟血管性痴呆大鼠神经细胞c－fos、c－jun蛋白表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（9）：1096－1098.

［12］谢道俊，江停战，汪远金，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠神经细胞凋亡Fas／FasL蛋白表达的影响［J］.中国临床保健杂志，2007，10（6）：604－606.

［13］靳伟，谢道俊，何静.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆患者血清SS、AVP的影响［J］.中医药临床杂志，2010，22（11）：981－983

［14］钟宏丽，谢道俊，何静.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆患者血清NO、NOS的影响及疗效评价［J］.中医药临床杂志，2010，22（11）：983－984.