郭 静，段 渠，杜艾嫒，钟振东

1)成都中医药大学临床医学院 成都 610075 2)四川省医学科学院;四川省人民医院实验动物研究所 成都 610072

荨麻疹是皮肤科临床常见的变态反应性疾病，是由于皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应，主要表现为风团反复发作伴剧烈瘙痒;反复发作数月以上者称为慢性荨麻疹[1]。该病发病涉及多种细胞和介质，故病因及病理机制非常复杂。慢性荨麻疹属中医“瘾疹”范畴。中医认为，禀赋不耐，病久体虚，脾肺虚弱，气血不足，卫外失司，风邪乘虚而入，其基本病机属正虚邪恋之顽症[2-3]。加味三甲散出自明朝吴又可的《瘟疫论》[2]，由鳖甲、龟甲、穿山甲等13味中药组成，主治瘟疫伏邪已溃，正气衰微，不能托出表邪，客邪胶固于血脉，主客交浑，肢体时疼，脉数身热，胁下锥痛，过期不愈，致成痼疾者。该方主要用于疫症后期的治疗，但根据该方的整体特性，只要辨证属于正虚邪恋之重症顽疾，一般方法用之无效或不佳，即可援引于临床，如用于对慢性荨麻疹的治疗[4]。作者观察了加味三甲散对被动皮肤致敏型大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg基因表达的影响，探究其用于治疗慢性荨麻疹的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证号:SCXKC(111)2008-24。

1.2 药物、主要试剂与仪器 药物:加味三甲散提取浓缩液，氯雷他定片(江苏恒瑞制药股份有限公司生产)。主要试剂:卵白蛋白(Sigma公司)，卡介菌疫苗(成都生物制品研究所提供)，RNAiso Plus Kit(批号 BK3303)、PrimeScript RT reagent Kit(货号BK501)及SYBR Premix Ex TaqⅡ Kit(批号BK402)均购自大连宝生物工程有限公司。仪器:电子天平(BS-600L，上海友声衡器有限公司)，RT-PCR扩增仪(PIKORed96，美国ThermoFisher仪器有限公司)，匀浆机(DY89-I，宁波新芝生物科技股份有限公司)，图像分析软件(Motic Images Advanced)。

1.3 实验动物分组及给药 60只SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表分为6组:正常对照组，模型对照组，氯雷他定组(阳性对照组)及加味三甲散高、中、低剂量组，每组10只。给药前1 d，除正常对照组外，余5组大鼠按文献[5-6]制作被动皮肤致敏模型。氯雷他定组按10 mL/kg剂量灌胃给予氯雷他定溶液，加味三甲散给药组分别按38.0、19.0、9.5 g/kg剂量对应高、中、低剂量组灌胃给予加味三甲散提取浓缩液，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积纯净水。各组动物每天灌胃1次，连续3周。

1.4 外周血单核细胞中CD4+CD25+Treg mRNA表达的检测 收集各实验组大鼠血液，4000 r/min离心10 min，弃上清液，收集沉淀，采用一步法提取总RNA，逆转录为cDNA。从NCBI数据库中搜索下载大鼠 β-actin(NM_007393.3)和 CD4+CD25+Treg(NM_001048141.1)基因全序列，使用Primer Premier 5.0软件设计筛选各基因特异性引物，见表1。PCR反应条件:95℃预变性30 s;95℃变性5 s，55℃退火30 s，40个循环;72℃延伸30 s，得到每个样品的Ct值。采用2－ΔΔCt法计算目的基因的表达量。ΔΔCt= (Ct目的基因－ Ct内参)实验组－ (Ct目的基因－Ct内参)对照组。

表1 基因引物序列及目标产物大小

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较各组大鼠CD4+CD25+Treg mRNA的表达水平，方差齐者组间进行LSD-t检验，方差不齐者进行Tamhane's T2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

各组大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA表达的比较见表2。由表2可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA的表达降低;与模型对照组比较，加味三甲散高、中、低剂量组大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA的表达升高。

表2 各组大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA表达的比较

3 讨论

嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺和其他炎性介质是荨麻疹发病的中心环节。引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒的机制主要有3大类:免疫性、非免疫性和特发性[7]。自20世纪80年代起，对调节IgE合成的各种因子的研究中，Th1/Th2失衡学说占据主导地位。但随着CD4+CD25+Treg细胞和FOXP3转录因子的发现，对于慢性荨麻疹的发病机制有了新的认识。有研究[8]发现慢性荨麻疹患者外周血单核细胞中CD4+细胞数明显高于正常人群，其中CD4+CD25+Treg表达也明显高于对照组。这一现象是否是由于CD4+CD25+Treg细胞功能上的缺陷导致患者外周血中CD4+CD25+细胞代偿性增殖，以数量来弥补其功能上的不足，以及中药能否通过这一途径达到治疗效果值得关注。

调控免疫性发病机制是控制荨麻疹病情的重要环节。CD4+CD25+Treg细胞是调节性T细胞的一个重要亚类，其对自身抗原和非己抗原均有较强的免疫抑制作用。Hori等[9]发现CD4+CD25+Treg细胞上的一个表面受体OX40可以通过细胞接触与依赖FcεRI的肥大细胞表面的OX40L结合，促使肥大细胞内环磷酸腺苷含量增加，导致Ca2+内流减少，减少肥大细胞脱颗粒和过敏反应，从而减轻荨麻疹的临床症状。该实验结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA的表达降低;与模型对照组比较，加味三甲散各剂量组外周血单核细胞CD4+CD25+Treg mRNA的表达均升高，提示加味三甲散可上调被动皮肤致敏型大鼠外周血细胞异常下降的CD4+CD25+Treg mRNA水平，对慢性荨麻疹患者外周血单核细胞中CD4+CD25+Treg细胞功能的缺陷可能具有一定的干预作用，与上述研究一致。

[1]赵辨.临床皮肤病学[M].南京:江苏科学技术出版社，2001.

[2]吴又可.瘟疫论[M].北京:中国医药出版社，2011.

[3]莫宗成，王天文，聂飞，等.慢性荨麻疹的中医治疗进展[J].重庆中草药研究，2010(1):38

[4]张云平.活血祛风汤治疗慢性荨麻疹66例疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(4):243

[5]肖红丽，眭道顺，李东海，等.当归饮子对小白鼠被动皮肤过敏反应及血清白三烯B4水平的抑制作用研究[J].四川中医，2008，26(7):9

[6]李旭波，李娜，侯颖，等.玉屏风散加味治疗慢性荨麻疹的作用及机制[J].第四军医大学学报，2009，30(5):462

[7]黄小雄，邹循辉，黄和文，等.慢性荨麻疹患者单-核细胞体外培养观察IL-4及IFN-γ水平的变化[J].岭南皮肤性病科杂志，2004，11(2):112

[8]Chen WC，Chiang BL，Liu HE，et al.Defective functions of circulating CD4+CD25+and CD4+CD25－T cells in patients with chronic ordinary urticaria[J].J Dermatol Sci，2008，51(2):121

[9]Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science，2003，299(5609):1057