马珊珊，刘 静，姚 宁，崔渊博，邢 衢，王梦然，郭天宇，杨 波，关方霞1，

1)郑州大学生命科学学院干细胞实验室 郑州 450001 2)华东师范大学生命科学学院 上海 200241 3)中山大学生命科学学院 广州 510275 4)郑州大学第一附属医院 郑州 450052

衰老是机体的细胞、组织及器官在结构和功能上逐渐出现的不可逆转的全面退行性变化。目前研究[1]认为，衰老是干细胞衰退、DNA退化、饮食及精神因素、衰老基因活跃等综合作用的结果，但仍未形成统一的衰老理论。细胞衰老是受某些基因控制、借助于信号转导途径实现的，其中P16/Rb和P53控制的信号途径至关重要[2-4]。研究[5-6]发现，在衰老细胞中p16基因处于高表达水平。该研究首先构建p16基因高表达载体，然后将高表达载体转染293细胞，并观察p16基因高表达对293细胞增殖、细胞周期及衰老的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞 293细胞为郑州大学生命科学学院干细胞实验室保存的人肾上皮细胞，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养，常规传代。

1.2 主要试剂 Trizol和Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒、逆转录试剂盒和β-半乳糖苷酶染色试剂盒均购自TaKaRa公司，Western blot相关试剂和抗体均购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.3 p16基因高表达载体的构建 取对数生长期的293细胞，消化后离心，收集细胞，用Trizol提取细胞总RNA，然后用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA模板。根据p16 mRNA序列(GenBank登录号为:U26727.1)设计引物，RT-PCR扩增p16基因ORF序列(上游引物为5'-GCCGGAAGCTTATG GTGCGCAGGTTCTTGGT-3'，下游引物为 5'-CTAAT GGTACCCAGCCAGGTCCACGGGCAGA-3'，下划线碱基表示引入的酶切位点)。反应条件为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环;72℃延伸5 min，4℃终止反应。然后将扩增片段酶切后插入到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位点之间，构成重组质粒 pEGFPN1-p16ORF。

1.4 p16基因高表达载体转染293细胞 用Lipofectamine2000将p16基因高表达载体转染293细胞，操作步骤严格按照说明书进行。将293细胞分为3组:正常组、空质粒组(转染pEGFP-N1)、高表达组(转染pEGFPN1-p16ORF)，每组3个复孔。各组细胞均置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养，48 h之后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况。

1.5 CCK-8法检测p16基因高表达对293细胞增殖的影响 细胞分组及处理同1.4。各组细胞每天同一时间加入10 μL CKK-8溶液，于细胞培养箱中继续培养2 h，检测细胞在450 nm波长下的吸光度值，连续测6 d，记录数据，绘制细胞生长曲线。

1.6 PI染色法检测p16基因高表达对293细胞周期的影响 细胞分组及处理同1.4。培养24 h后消化、收集各组细胞并计数，调整细胞密度为2×106mL－1。取1 mL单细胞悬液，离心后去除上清，在细胞中加入2 mL体积分数为70%的冰乙醇固定过夜。用PBS洗去固定液，加入2.5 μL 10 g/L RNase A并置于37℃水浴30 min。避光加入PI染料，4℃30 min。上流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 RT-PCR法检测各组293细胞中p16和p21 mRNA的表达 细胞分组及处理同1.4。首先采用Trizol法抽提各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，采用RT-PCR试剂盒并按说明进行操作，采用β-actin作为内参。引物序列见表1。反应条件:95℃30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。数据分析采用比较CT法，mRNA相对表达量=2－ΔΔCT。

表1 引物序列

1.8 Western blot法检测各组293细胞中P16和P21蛋白的表达 细胞分组及处理同1.4。收集3组细胞，提取总蛋白。加入适量蛋白抽提试剂，冰上孵育30 min，让细胞充分裂解。蛋白样品中加入5×上样缓冲液，沸水中煮10 min，再迅速冰浴5 min，分装后置于－20℃保存备用。经SDS-PAGE凝胶电泳及转膜后于体积分数5%的脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入鼠抗 P16一抗(1∶500稀释)、P21一抗(1∶1000稀释)过夜孵育，TBST洗膜3次，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗在室温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影成像，最后用Image J图像分析软件进行蛋白灰度分析。

1.9 各组293细胞β-半乳糖苷酶表达的检测 细胞分组及处理同1.4。吸取各组细胞培养液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10 min。去除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。然后每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育2 h。普通光学显微镜下观察，蓝染细胞为衰老细胞。100倍镜下选取5个视野，观察并计算阳性细胞百分率。

1.10 统计学处理 采用 SPSS 19.0进行数据分析。3组间细胞周期分布、p16及p21 mRNA和蛋白相对表达量、β-半乳糖苷酶阳性细胞率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 p16基因高表达载体转染293细胞 结果见图1。

2.2 p16基因高表达对293细胞增殖的影响 各组293细胞生长曲线见图2。

2.3 p16基因高表达对293细胞周期的影响 结果见表2。高表达组G0/G1期细胞增加，S期、G2/M期细胞减少。

图1 各组293细胞GFP的表达(×100)

图2 各组293细胞的生长曲线

表2 各组293细胞周期的变化 %

2.4 RT-PCR检测各组293细胞中 p16和 p21 mRNA的表达 结果见表3。可知高表达组中p16和p21 mRNA的表达上升。

2.5 Western blot检测各组293细胞中P16和P21蛋白的表达 结果见图3和表4。可知，高表达组P16和P21蛋白的表达上升。

2.6 各组293细胞中β-半乳糖苷酶表达的检测高表达组293细胞β-半乳糖苷酶的表达上升(图4和表5)。

表3 各组293细胞中p16、p21 mRNA的表达

图3 各组293细胞中P16和P21蛋白的表达

表4 各组293细胞中P16、P21蛋白的表达

图4 各组293细胞β-半乳糖苷酶染色情况(×40)

表5 各组293细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率 %

3 讨论

Han等[7]研究发现P16蛋白能增加P21蛋白的稳定性，P21蛋白则通过转录因子Sp1激活p16基因的表达，二者协同抑制细胞周期。细胞周期的停滞是细胞衰老的前提，细胞衰老伴随着细胞形态的改变和相关基因表达的变化[6，8-10]。研究[11]表明利用脂质体介导p16 cDNA真核表达载体转入p16阴性的人红白血病细胞株后，细胞增殖受到抑制，凋亡率增加。该实验将p16基因高表达载体转染至293细胞，结果显示p16基因高表达抑制了293细胞的增殖并将细胞阻滞在G0/G1期，而且p16基因高表达可以上调细胞衰老相关基因 p21的表达，说明p16基因可能通过促进p21基因的表达导致细胞衰老。

细胞衰老的指标中，除p21表达升高外，β-半乳糖苷酶的表达亦升高。有研究[12]发现体外培养的人二倍体成纤维细胞在pH为6时，其β-半乳糖苷酶阳性率随着代龄增加而增加，因此β-半乳糖苷酶是目前公认的检测细胞衰老的金标准。该实验中作者发现p16基因高表达载体导致293细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞率上升，说明细胞已呈现衰老状况。

总之，该研究说明p16基因在细胞衰老过程中发挥调控作用，并初步建立了p16基因高表达的细胞衰老模型，为进一步研究细胞衰老的机制奠定了基础。

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