冯 龙，郭文涛，路武豪，孙萨迦，董子明#

1)河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科 郑州 450008 2)漯河医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室 漯河 462002 3)郑州大学基础医学院病理生理学教研室 郑州 450001

DNA 聚合酶 β(DNA polymerase β，DNA polβ)是碱基切除修复过程中的关键酶[1-3]。polβ最主要的功能是在碱基切除修复中填补由碱基切除所产生的非常短的核苷酸缺口[4]。研究[5-6]发现，DNA polβ 在多种肿瘤组织和细胞内存在高水平表达，并且与一些肿瘤的发生有关。因此，进一步研究DNA polβ在DNA修复中的作用机制，以及该酶在人类肿瘤组织中的表达特征，已经成为肿瘤分子机制研究中的一个热点[7]。基因敲除是研究组织或器官中基因功能的重要手段，已经成功地应用在各种类型的细胞中[8]，并且，人类体细胞基因敲除也获得成功。为了深入研究DNA polβ突变和异常表达在食管癌发病中的作用，作者建立人食管癌Eca9706细胞DNA polβ基因敲除模型，为深入研究DNA polβ的生物学功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株 Eca9706细胞是高分化食管鳞状细胞癌细胞，2002年从一中国来源的高分化食管鳞状细胞癌的男性患者肿瘤组织中分离并建系。

1.2 基因敲除载体构建 以Eca9706细胞基因组为模板，设计上游和下游同源序列引物，PCR扩增得到上游(1280 bp)和下游(1756 bp)同源序列，分别将其克隆入骨架载体pcDNA3.1(包含neo基因，用于G418筛选)中，经酶切和PCR扩增鉴定获得阳性克隆重组子pOUT-polβ，最后用限制性内切酶EcoR V使其线性化。

1.3 细胞导入方法 采用电穿孔法将线性化的打靶载体pOUT-polβ导入Eca9706细胞中。将扩增后的Eca9706细胞用胰蛋白酶消化后重悬于PBS中，使细胞密度达到2×107mL－1以上。将50 μg线性化的打靶载体DNA与1 mL细胞混匀，装入电穿孔槽中电击，电击参数:600 V，25 Μf，200 Ω，电击时间为7 s;然后将电击后的细胞分装入长满Eca9706细胞的培养皿中，24 h后换成Eca9706细胞筛选培养液(含G-418800 mg/L的DMEM培养基)，并设对照组(正常的Eca9706细胞)，2～3 d换液1次，观察培养细胞，挑选单克隆，同样条件筛选培养。将鉴定后获得的基因敲除细胞株用G-418维持质量浓度(200 mg/L)扩大培养。

1.4 PCR检测基因敲除细胞中DNA polβ基因敲除区段DNA存在情况 参照QIAGEN公司基因组提取试剂盒说明，提取细胞基因组DNA，设计并合成DNA polβ引物(上游引物:5'-AAAGGATTCCAGATAAA CAC-3';下游引物:5'-GCTGGAAGGAAAGAAGAAAG-3')，扩增片段长度499 bp。PCR扩增鉴定敲除细胞中DNA polβ基因敲除区段DNA存在情况，并同时扩增对照组Eca9706细胞中DNA polβ基因。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，34个反应循环;72℃再延伸2 min。PCR产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 RT-PCR检测细胞中DNA polβ mRNA表达情况 Trizol法提取细胞总RNA，AMV酶逆转录成cDNA，使用 polβ 引物(上游:5'-GAGAAGAACGTGAGC CAAGC-3';下游:5'-CATCCATGTCACCACTGGAC-3')和内参 β-actin引物(上游:5'-ACACTGTGCCCATC TACGAGG-3';下游:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3')分别扩增基因敲除细胞和Eca9706细胞。DNA polβ扩增片段长度为499 bp。PCR产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 Western blot检测细胞中DNA polβ蛋白表达情况 收集基因敲除后的Eca9706细胞及对照组Eca9706细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝染色法测蛋白浓度。取20 μL待测样品置于12 g/L聚丙烯酰胺凝胶上，电泳3 h后转移到硝酸纤维素膜上。剪下有目的条带的膜放入复性剂中，5 min后放入1∶100稀释的特异性鼠抗人DNA polβ单克隆抗体中，4℃过夜;加入1∶100稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，室温振荡2 h后用封闭液洗涤，DAB显色。

1.7 流式细胞术检测细胞周期 用血清饥饿法对细胞进行同步化处理，使细胞周期停滞在G0期。基因敲除细胞和对照组Eca9706细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化处理后，制成单细胞悬液。每组取1×106个细胞，PBS洗2次，加入预冷的体积分数70%乙醇，－20℃固定30 min，检测前离心去除乙醇，生理盐水洗涤2次，加入含10 mg/L碘化丙啶和质量分数0.1%RNA酶的PBS，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪于488 nm波长处进行检测，分析细胞周期。实验重复3次。

1.8 基因敲除细胞和对照组Eca9706细胞生长曲线的绘制 分别取对数生长期的基因敲除细胞和对照组Eca9706细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，每组5个复孔，分别于接种后的第1～7天加MTT(5 g/L)，20 μL/孔，37 ℃、体积分数 5%CO2温箱中继续孵育4 h，弃上清后加DMSO 150 μL/孔，37℃振荡20 min，使结晶充分溶解，于490 nm波长处在酶联仪上测定各孔吸光度值，以时间为横轴、吸光度值为纵轴，绘制2组细胞生长曲线。

1.9 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计学分析。所有数据行正态性和方差齐性检验，2组间细胞周期分布的比较采用两独立样本的t检验。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 基因敲除细胞中DNA polβ基因敲除区段DNA存在情况及DNA polβ mRNA和蛋白的表达情况提取细胞基因组DNA，PCR鉴定DNA polβ基因敲除区段DNA存在情况。对照组Eca9706细胞可见一明显条带位于500 bp处，而 DNA polβ基因敲除的Eca9706细胞未见条带，说明靶基因已被敲除(图1)。提取细胞基因组RNA，RT-PCR检测polβ mRNA表达水平，Eca9706细胞组可见一明显条带位于500 bp处，基因敲除Eca9706细胞组未见条带，说明含有基因敲除载体并携带neo抗性基因的Eca9706细胞中DNA polβ mRNA表达缺失(图2)。Western blot结果显示:在相对分子质量39000处可见正常Eca9706细胞DNA polβ蛋白表达，而基因敲除Eca9706细胞未表达(图3)。

图1 DNA polβ基因敲除区段DNA存在情况的PCR鉴定结果

图2 基因敲除Eca9706细胞中DNA polβ mRNA表达情况鉴定结果

图3 基因敲除Eca9706细胞中DNA polβ蛋白表达情况鉴定结果

2.2 敲除DNA polβ基因的Eca9706细胞的生长曲线和细胞周期

2.2.1 细胞生长曲线 见图4。由生长曲线可以看出，基因敲除细胞生长曲线较平缓，细胞生长速度较正常细胞降低。

图4 敲除DNA polβ基因的Eca9706细胞与Eca9706细胞的生长曲线

2.2.2 流式细胞术检测细胞周期 2组细胞周期分布见表1。可知，2组G2～M期、S期细胞百分比比较，差异有统计学意义;而G0～G1期细胞百分比比较，差异无统计学意义。

表1 2组细胞周期分布 %

3 讨论

3.1 DNA polβ基因敲除载体的构建 基因敲除技术是根据同源重组的原理，使外源目的基因与受体细胞染色体DNA上的同源序列发生重组，并将目的基因整合在预定位点，以改变细胞遗传特性为目的的分子生物学技术[9]。实验过程受到重组效率低、目的片段随机插入等诸多因素的影响，因此，打靶载体的设计和构建是基因敲除技术的关键环节，在很大程度上决定着实验的成败。该研究所构建的打靶载体，用目的基因替换DNA polβ基因的部分同源序列，目的是破坏DNA polβ基因的生物功能。该打靶载体全长约7800 bp，上游同源序列长约1280 bp，下游同源序列长约1756 bp。一旦发生同源重组，它将替换掉DNA polβ基因启动子的核心区，而且还将替换掉DNA polβ 基因第1、2、3外显子和第1、2 内含子的全部以及第3内含子的大部分，导致DNA polβ基因功能的丧失。

3.2 基因敲除对细胞周期及细胞增殖的影响 敲除DNA polβ基因后，靶细胞的细胞周期和细胞增殖也随之发生变化。表现为与对照组Eca9706细胞相比，基因敲除细胞的S期细胞明显减少，细胞生长曲线变平缓。基于以上研究结果可知，无DNA polβ基因的Eca9706细胞，其细胞增殖及细胞基因组的稳定性受到一定的影响。由于该实验是在体细胞水平进行 DNA polβ基因敲除，因此，敲除后的Eca9706细胞仍然能够正常生长。相反，若DNA polβ基因过表达则可导致细胞持续恶性转化，生长速度加快。因此，敲除DNA polβ基因可以减缓肿瘤细胞的增殖，进一步深入研究后有望运用于人类肿瘤的生物治疗。

综上，作者建立人食管癌Eca9706细胞DNA polβ基因敲除模型，从根本上消除实验中细胞DNA polβ本底对实验数据的干扰，为深入研究DNA polβ突变和异常表达在食管癌发病中的作用提供了实验基础。

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[5]刘亮，左静，赵丽，等.ABCG2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG2的建立[J].解放军医学杂志，2010，35(1):32

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[8]刘亮，左连富，王静.青蒿琥酯对食管癌Ec9706细胞线粒体膜电位及凋亡的影响[J].解放军医学杂志，2014，39(1):25

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