高 玟 陈艳红 刘志良 罗庆丰 黄传生 涂 侃

乳腺癌是我国妇女高发的恶性肿瘤之一，其发病率占妇女肿瘤的31%。近年来针对HER-2表达的靶向治疗方案是主要其辅助治疗，是近期乳腺癌规范治疗中的研究热点[1]。应用免疫组化法检测该肿瘤患者标本的CerbB-2蛋白表达情况，是乳腺癌HER-2基因表达重要筛查方法，探索出恒温冷冻切片后样本进行检测CerbB-2蛋白表达是否可行，为CerbB-2蛋白检测样本的规范化处理和乳腺癌的手术后规范的辅助治疗作出有益的探索。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集我院2008年10月-2011年8月期间收治的乳腺浸润性导管癌患者130例，均为女性，年龄37～66岁，平均年龄56.7岁。

1.2 方法

1.2.1 恒温快速冷冻切片方法 取5 mm厚度组织，加入OCT包埋剂，置入冰冻恒温快速冷冻切片机冷冻5 min，待OCT包埋剂变白硬化后，按5 μm厚度切片，裱在防脱玻璃片，行HE染色，封片，阅片。

1.2.2 CerbB-2蛋白检测 采用MaxvisionTM免疫组化法，按照免疫组化试剂盒的操作说明进行。CerbB-2蛋白为工作液，具体步骤：①4 μm连续切片，裱于涂有APES的载玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；③3%过氧化氢室温孵育30 min，消除内源性过氧化物酶；④抗原修复：切片浸于pH 6.0柠檬酸溶液中，电饭锅中煮沸5 min，保温10 min，自然冷却；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥加入已知 CerbB-2蛋白抗体，4 ℃冰箱12 h；⑦复温，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧滴加Maxvision试剂，室温作用1 h；⑨PBS洗3 min×2次；⑩DAB光镜下显色，苏木精复染，封片[1]。光镜下观察CerbB-2蛋白在乳腺癌组织中表达。阳性对照：已知 CerbB-2蛋白强阳性乳腺癌组织切片；阴性对照：已知 CerbB-2蛋白阴性乳腺癌组织切片和PBS代替一抗染色切片。

1.2.3 结果判断 细胞膜呈棕黄色颗粒沉着者为CerbB-2蛋白阳性。根据着色强度及着色癌细胞比例将染色结果分为-、+、++和+++级：无显色为-，任何比例的浸润性癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色为+，浸润性癌细胞>10%呈现弱至中等程度、完整但不均匀的细胞膜棕黄色着色或浸润性癌细胞<30%呈现强且完整细胞膜棕褐色着色为++，浸润性癌细胞>30%呈现强且完整细胞膜棕褐色着色为+++。

1.3 阅片

在普通光学显微镜下，由两名经验丰富的病理科医师对冷冻切片后对应的组织和剩余组织常规切片，的免疫组化切片进行单独双盲阅片,记录诊断结果，按配对资料比较两种方法的一致性。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，采用配对资料χ2检验和一致性检验分析。

2 结果

130例浸润性导管癌冷冻组织对应样本中42例不表达CerbB-2,33例CerbB-2 表达+，34例CerbB-2 表达++，21例CerbB-2表达 +++;剩余组织常规切片样本中56例CerbB-2表达阴性,50例CerbB-2 表达+，19例CerbB-2 表达++，5例CerbB-2表达+++;两组标记结果比较具有显著性差异(χ2=134.04,P<0.01)，而且两组CerbB-2阳性表达结果一致性较差(kappa值=0.39，P>0.05),见表1。

3 讨论

乳腺癌靶向治疗是近期发展较快且有成效的治疗手段，CerbB-2是表皮生长因子受体家族成员之一，定位于人17染色体q21区带，是185kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，参与多种信号的传导，已有临床研究显示[2]：对于CerbB-2受体过表达的乳腺癌患者，采用1种人源化的单克隆抗体类药物Herceptin是安全有效的药物，阴性患者Herceptin无效，表明CerbB-2是乳腺癌靶向治疗的有效靶点，但是靶向治疗药物常常费用昂贵，因此准确检测乳腺癌CerbB-2表达情况对于乳腺癌术后规范的辅助治疗具有重要意义。

表1 130例乳腺癌组织中 CerbB-2蛋白表达情况/例

恒温快速冷冻切片技术能快速明确各种肿瘤患者的病理诊断和分级，特别是在手术过程中尤为重要[3]，在乳腺癌患者中显著提高了诊断准确率和明确的阴性手术切缘，在乳腺癌患者规范化的治疗中起到重要作用[4]，该技术得到广泛应用，但是目前没有发现有关恒温冷冻切片对于患者CerbB-2蛋白检测影响的研究，我们选择了130例乳腺浸润性导管癌患者，对恒温冷冻切片后对应同一组织进行石蜡切片CerbB-2蛋白表达检测，检测结果阳性率为3.80%。同时对该患者剩余组织的石蜡切片进行CerbB-2蛋白检测，阳性结果16.20%，两组结果差异比较具有非常显著统计学意义，在恒温冷冻切片后对应组织的石蜡切片中发现CerbB-2蛋白出现弥散，定位不准确，阳性强度减弱等现象，因为CerbB-2蛋白是1种跨膜糖蛋白，在快速冷冻情况下，细胞的细胞膜因温度的短期内激烈的改变产生跨膜结构破坏，导致细胞膜结构的破坏，从而影响阳性表达定位，细胞质内出现阳性颗粒。研究表明恒温冷冻切片对乳腺癌Cerb-2表达影响较大，减低Cerb-2阳性表达，因此工作中应该尽量避免使用恒温冷冻切片后的同一样本进行乳腺癌Cerb-2表达检测，以免误导治疗，减少患者不必要的医疗负担和浪费。

随着乳腺癌患者规范化治疗的进展，恒温冷冻切片技术应用和Her-2蛋白的检测将会越来越广泛，本研究发现恒温快速冷冻切片技术会减低免疫组化法检测Her-2蛋白的阳性表达，对于免疫组化法检测前检测样本的标准化处理流程具有重要意义，同时有必要进一步研究恒温快冷冻切片技术对FISH法检测乳腺癌Her-2基因的影响，更为准确的提供乳腺癌相关蛋白和基因检测前样本处理的规范化流程[5]。

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