孙彩霞 宋藏珠 徐 庆 景邵武 王 军

上皮性卵巢癌是女性最致命的的恶性肿瘤之一，在妇科肿瘤中死亡率位居第一。今年来发病呈现上升趋势，已经严重影响女性生命健康。由于目前尚没有有效的早期诊断方法，70%的患者就诊是已属晚期。对于晚期患者的一般治疗手段为肿瘤细胞减灭术的基础上辅以以铂类为主的联合化疗方案治疗[1]。但是由于肿瘤细胞对铂类药物耐药性的产生，即使是初始治疗的有效率达到70%[2]，但是大部分的卵巢癌患者还是死于耐药导致的复发[3]。所以进展期(晚期)上皮卵巢癌患者5年生存率仅为30%[4]。卵巢癌耐药产生的分子机制得到了广泛的研究，但是miRANs在此方面的研究甚少。最新研究发现，在铂类耐药的细胞株A2780中，miR-141表达上调，当在卵巢癌细胞株中过表达miR-141导致其对铂类药物的耐受[5]。在本研究中，我们应用real-time PCR技术,检测了miR-141在上皮性卵巢癌组织中的表达水平，以及与卡铂敏感性的关系，并检测转染 miR-141 mimics 后，上皮性卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2对卡铂敏感度的变化。

1 材料与方法

1.1 标本来源及卵巢癌细胞株

68例上皮性卵巢癌组织标本，均取自河北医科大学第四医院妇科2006年-2007年收治的晚期(FIGOⅢ-Ⅳ期)上皮性卵巢癌住院患者的手术切除标本，年龄31～78岁，平均(57.2±8.5)岁，患者术后病理检查证实为上皮性卵巢癌，且术前未行放疗、化疗。正常对照组为30例卵巢癌良性肿瘤标本。组织标本均在标本离体后立即放入液氮罐中，-150 ℃保存。卵巢癌病例均随访5年以上。浆液性卵巢癌细胞株SKOV-3和人卵巢透明细胞癌细胞 ES-2由河北医科大学第四院科研中心提供。

1.2 主要试剂

miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)试剂盒，RNA酶抑制剂、MMLV反转录酶及10×RT缓冲液(Epicentre公司)，2.5 mM dNTP混合液(HyTest Ltd公司)，SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara公司)，MTT (Sigma公司),miR-141 mimics(Invitrogen公司),Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)，real-time PCR引物及microRNA颈环反转录引物合成(北京中美泰和生物技术有限公司)，引物见表1。

表1 引物序列表

1.3 miR-141表达水平的测定

按照miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)试剂盒的产品说明书提取所取标本的miRNAs，反转录得到所测目的基因miR-141和内参U6的cDNA，按照YBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara公司)产品说明书,采用real-time PCR方法检测标本中miR-141的表达情况。采用2-△CT方法表示miR-141的相对表达量，△CT sample=CTsample-CT U6sample。

1.4 术后规范化化疗及其疗效评估

对所有患者进行肿瘤细胞减灭术后辅以规范的铂类为主的联合化疗方案(紫杉醇 175 mg/m2iv d1,卡铂 AUC5 iv d1,q21×6)治疗。所有病例每2个周期进行一次疗效评估，化疗结束后每月进行一次全面评估。将评估结果分为卡铂耐药和卡铂敏感。卡铂耐药即为卡铂联合化疗中病情进展或化疗结束后无化疗间隔(TFI)6个月内肿瘤复发；卡铂敏感即为铂类化疗有效，化疗结束后无化疗间隔大于6个月肿瘤复发。

1.5 miR-141mimics的转染

用LipofectamineTM 2000将miR-141 mimics转入卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2中，设为实验组。同时设阴性mimics转染的卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2为对照组，未做任何处理的卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2作为阴性组。转染24 h后采用real-time PCR检测转染效果。

1.6 MTT法检测细胞增殖抑制率

SKOV-3和ES-2细胞转染24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，以每空2×103个细胞接种于96孔板中进行细胞培养，并给与卡铂的干预，根据临床常规用药剂量,参考公式log( PPC)=-0.788+[0.755×log( LD50) ][6]得出试验设定药物浓度为320.8 μg /L。每组5个复孔，同时各设不加药对照。分别于干预24 h、48 h后，每空加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每空加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，使结晶充分溶解，应用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(A值)，取相同生长天数及转染相同质粒的A值的均值作为该组细胞某天的A值，计算不同转染组SKOV-3和ES-2细胞相对增殖率。

1.7 克隆形成实验

SKOV-3和ES-2细胞转染24 h后，取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，接种于直径10 cm的培养皿中，3 000个细胞/皿，用含有卡铂(终浓度为320.8 μg /L)的培养基，同是设无卡铂干预的阴性对照，于37 ℃、CO2体积分数为5% 的饱和湿度条件下，静置培养2周。观察，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加70%乙醇3 ml固定15 min。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液10～30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%。

1.8 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布样本，均数比较采用两样本的t检验，不符合正态分布的样本比较采用Wilcoxon ’ rank-sum(Mann-Whitney) U检验，两计量样本的相关性采用Pearson检验，等级标本的相关性采用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢上皮癌组织和卵巢良性肿瘤中miR-141表达情况

30例卵巢良性肿瘤标本中miR-141平均表达水平为(0.09±0.0032)，68例卵巢上皮癌组织中miR-141平均表达水平为(5.03±0.17)，两组比较有显著性差异(P=0.0014)。68例卵巢上皮癌组织中有58例miR-141的表达水平高于良性肿瘤的平均表达水平，占85.3%，其相对表达水平为(5.54±0.11)；10例miR-141的表达水平低于良性肿瘤的平均表达水平，占14.7%，其相对表达水平为(0.03±0.0093)。

2.2 术后规范化化疗疗效

68例患者中除3例化疗过程中病情进展外，其余均完成6个周期的规范化疗。卡铂耐药患者19例(19/68,27.9%)，卡铂敏感患者49例(49/68,72.1%)，见表2。

2.3 卵巢上皮癌组织中miR-141表达与卡铂敏感性及其5年生存率的关系

卡铂敏感患者与卡铂耐药患者miR-141表达水平存在明显差异(P=0.002)。miR-141表达与患者对卡铂的敏感性呈显著负相关(γ=-0.782,P=0.003)。生存期超过5年与不足5年患者miR-141的表达存在显著差异(P=0.032)，miR-141表达与患者生存期呈显著负相关性(γ=-0.5296,P=0.013)，见表2。

2.4 miR-141表达与上皮性卵巢癌组织临床病理特征的关系

miR-141表达与卵巢上皮癌患者年龄、病理类型、组织学分级、FIGO分期、残留肿瘤大小均无相关性(P>0.05)，见表2。

2.5 real-time PCR 检测结果

卵巢癌细胞株SKOV-3和ES转染后，real-time PCR检测结果显示，实验组miR-141表达水平明显高于对照组和阴性组，分别为(7.30±0.37)、(1.24±0.19)、(1.50±0.08)(P=0.027，0.033)和(5.97±0.57)、(0.98±0.16)、(1.10±0.07)(P=0.011,0.013)。

2.6 MTT法检测结果

MTT法检测结果显示卡铂存在的条件下，转染miR-141 mimics组的增殖状况与其余两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。说明卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2转染miR-141 mimics后对卡铂的敏感度降低。

2.7 克隆形成实验检测结果

平皿克隆形成实验结果显示：卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2转染miR-141 mimicsd实验组、阴性mimics对照组和未作处理阴性组的克隆形成率分别为 (72.50±0.99)%、(23±0.90)%、(22±1.03)%和(80.30±0.99)%、(32.15±1.90)%、(35±1.33)%，结果显示miR-141 mimicsd实验组克隆数及克隆面积明显高于其余两组，差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

卵巢癌是女性最致命的的恶性肿瘤之一，且发病率逐年上升。有70%的患者确诊是已属晚期，对于晚期患者的一般治疗手段为肿瘤细胞减灭术的基础上辅以以铂类为主的联合化疗方案治疗[1]。卡铂是卵巢癌治疗最有效的抗癌药物之一，介导形成导致细胞死亡的铂-DNA复合物。阻碍卡铂治疗成功的主要障碍是药物耐药的产生，致使即使初始治疗的有效率达到70%[2]，5年生存率也仅为30%[4]。导致药物耐受的分子机制得到了广泛的研究，导致铂类敏感性降低的原因包括谷光氨肽导致的铂类化合物的失活增加[7]，在细胞内的积累减少[8]，凋亡途径的失活[9]还有就是铂-DNA损伤修复的改变[10]。然而，但是miRNAs在这方面的调节作用知之甚少。

表2 miR-141表达与卵巢上皮癌对卡铂敏感性、5年生存率及其临床病理特征的关系

图1 MTT法检测结果

MicroRNAs (miRNAs)是一类进化上高度保守的小分子非编码RNA，长度大约为21-23nt左右，具有转录后调控基因表达的功能。他们在组织中的表达有时序性和组织特异性，大约有30%的mRNA的转录表达受miRNA的调控，这表明miRNA在整个基因表达中发挥重要作用[15]。成熟的miRNA与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，通过其长度约为2-8nt的种子序列与其靶基因mRNA 3’分翻译区(UTR)中的互补序列结合，抑制其靶基因的表达。约有30%的基因是miRNAs的靶基因，并且一个miRNA的种子序列可能与成百上千个基因的mRNA结合，即一个miRNA可能靶向作用于成百上千个基因[11]。有研究表明MiR-214/376c/125b的异位表达可分别通过抑制PTEN/ALK7/BAK1的表达增加上皮卵巢癌对铂类药物的耐受[12-13]。涉及药物敏感性的miRNA才刚刚起步，还有大量的工作需要做，以期发现和确定更多的miRNAs，他们的分子靶点和作用步骤。

本研究中，我们分析了68例上皮性卵巢癌组织中miR-141的表达情况与卡铂敏感性和患者5年生存率的关系，以期发现导致卵巢癌铂类耐药的新机制。结果显示miR-141表达与患者对卡铂的敏感性显著负相关(γ=-0.7816,P=0.0032)，miR-141的表达与患者5年生存率亦显著负相关性(γ=-0.5296,P=0.0128)，转染miR-141mimics后的卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2其卡铂耐药性明显增强。结果提示我们miR-141可能在上皮性卵巢癌的卡铂耐药性中发挥调节作用，高表达的miR-141能够增加上皮性卵巢癌对卡铂耐药性的产生，进而影响到患者5年生存率的高低。MiR-141作为miR-200家族的成员，在此家族成员与肿瘤干细胞的形成和EMT的调节有关[14-15]，我们的研究结果表明其可能在调控铂类药物敏感性方面发挥重要作用，为今后深入研究其调控作用的分子机制提供了可靠的实验基础。

综上所述，上皮性卵巢癌组织中miR-141的表达情况与卡铂敏感性和患者5年生存率存在显著相关性，检测皮性卵巢癌组织中miR-141的表达情况对预测上皮性卵巢癌对卡铂治疗敏感性、评估患者预后及提供合理的综合治疗措施具有重要的临床意义，有可能成为逆转耐药的有效新靶点。

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