刘佳怡, 王建青, 迪丽努尔·阿吉, 汪振华, 王 媛， 杨译辉

(1乌鲁木齐市口腔医院修复科, 乌鲁木齐 830002; 2新疆医科大学第一附属医院口腔修复科， 乌鲁木齐 830054)

先天性牙齿缺失是人类较常见的牙齿发育异常疾病，属牙发育异常中的数目异常，其发病率为1.6%～20%[1]。本课题组对新疆不同民族恒牙先天缺失情况进行的流行病学调查显示其总患病率为5.98%[2]。发生先天缺牙的原因是牙胚在形成过程中未能发育或未形成牙齿，或是在牙胚发育的早期，即牙蕾形成期的先天性异常[3]。现已证实家族遗传的先天缺牙可以常染色体显性、常染色体隐性或 X染色体形式遗传[4-7]。

本研究收集3个新疆维吾尔族先天缺牙家系，采取候选基因筛查法，检测与先天缺牙密切相关的轴抑制基因-2(AXIN2)片段在相关家系中的突变位置和类型，探讨先天缺牙家系患者相关基因的突变位点，从而为新疆维吾尔族人群先天缺牙的发病机制提供基因学参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1临床资料纳入标准：口内有不同程度先天缺牙，牙发育期无外伤史、放射史、孕期感染及服药史、拔牙史, 并且不伴有其他全身疾病。收集3个来自新疆医科大学第一附属医院口腔修复科门诊收治的维吾尔族非综合征型先天缺牙家系，患者9例(女性7例，男性2例)，其中表型正常者3例，年龄8～46岁。经专科检查并拍摄全口曲面断层片确认口内伴有不同数目的先天缺失牙, 诊断为非综合征型先天缺牙，系谱图如图1。同时随机抽取150例与先天缺牙家系无血缘关系的新疆医科大学在校维吾尔族学生作为健康对照组，年龄18～24岁。所有病例和正常对照组成员均签署知情同意书后提取其颊黏膜拭子样本，并通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核。

图1 先天性缺牙家系系谱图

1.2临床病例及家系情况收集家系一：先证者，女性(病例Ⅰ)，32岁，籍贯新疆，因全口多数牙缺失就诊；家系二：先证者，女性(病例Ⅴ)，21岁，籍贯新疆,先证者和其父(病例Ⅵ)口内情况见表1，2例表型正常者为先证者的姐姐；家系三：先证者，女性(病例Ⅷ)，11岁，籍贯新疆,先证者妹妹(病例Ⅶ)为混合牙列期，以上患者的口内缺失牙情况见表1。

该家系缺失最多的为第三磨牙,所有患者均有不同程度牙缺失,其次是第一前磨牙和第二前磨牙、侧切牙,并且病例Ⅰ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ伴有锥形牙的发生。3个家系成员不伴有其他系统性疾病的发生, 可初步诊断为非综合征型先天缺牙。3个家系先证者全口曲面断层片见图2。

表1 先天性恒牙缺失牙位记录

注： *为先天缺失牙位；▲为锥形牙牙位。

1.3方法

1.3.1 基因组DNA提取 采集患者和健康对照者颊黏膜拭子, 提取基因组DNA(按北京博迈德科技发展有限公司提供的试剂盒说明操作)，用紫外分光光度计ND1000检测所提取DNA的纯度及浓度, 光吸收值(260 nm/280 nm)为1.8～2.0判为DNA纯度合格。工作浓度为100 ng/μL,样本-20℃保存。

a：家系一(病例Ⅰ)

b：家系二(病例Ⅴ)

c：家系三(病例Ⅷ)

图23个家系先证者曲面断层片

1.3.2 PCR引物设计合成及PCR扩增 用GeneTool 1.0 Lite设计AXIN2引物(表2)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为50 μL:DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL, Master Mix 25 μL， ddH2O 21 μL。PCR 反应条件: 95℃预变性3 min, 94℃变性30 s；退火(57～59℃)30 s, 72℃延伸40 s, 共36个循环；72℃修复延伸5 min，以上反应在PCR仪上进行。取10 μL PCR产物, 2%琼脂糖凝胶150 V、100 mA、30 min电泳观察电泳检测产物特异性。

表2 AXIN2基因扩增引物序列

1.3.3 PCR 产物纯化及测序结果分析 AXIN2基因PCR扩增产物纯化及DNA双向序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。根据测序结果和系谱图, 应用DNAman软件并结合峰图进行比对分析。

2 结果

AXIN2基因PCR扩增片段为单一明亮的条带,并且出现在需要的特定位点上,表示PCR扩增合格(图3)。 对3个先天缺牙家系的9例患者进行基因检测并与野生型基因序列进行比对发现，病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的AXIN2基因在外显子2的第264位和第547位、外显子6第162位与外显子11的第922位和第1 141位点有突变。病例Ⅰ(家系一先证者)外显子2第264位点对应的密码子由ACA→GCA，苏氨酸变为丙氨酸，发生了错义突变(图4a)。第547位点对应密码子由CAA→CGA，谷氨酰胺变为精氨酸，也发生了错义突变(图4b)。病例Ⅲ(家系一先证者姐姐)外显子6第162位CCG→CTG，发生错义突变，脯氨酸变为亮氨酸(图4c)。病例Ⅰ(家系一先证者)外显子11第922位点对应密码子由GAT→GAG，发生错义突变，天冬氨酸变为谷氨酸(图4d)。病例Ⅰ(家系一先证者)第1 141位点对应密码子由ACT→ACA，仍编码苏氨酸，发生同义突变(图4e)。病例Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和150例健康对照DNA检测中均未发现突变位点。

图3 AXIN2基因PCR扩增片段分析

3 讨论

牙齿的发育是由多基因调控的复杂遗传过程[8], 有200多个基因参与了牙胚的发育过程[9-10]，且这些基因在空间上有序的调控作用决定了牙胚发育的进程[11]。AXIN2、MSX1、PAX9等基因是已经研究证实的与家族性先天缺牙有关的基因[12]。其在牙齿发育过程中表达于口腔上皮和其下方的间充质中，在前期成牙本质细胞、釉结、成牙本质细胞中也有表达[13]。AXIN2对牙胚发育的内源性信号WNT的影响也使其在牙胚的增殖、分化和凋亡中起到重要的作用[14-16]。

a： 病例Ⅰ(家系一先证者)； b： 病例Ⅳ(家系一先证者姐姐)； c：病例Ⅳ(家系一先证者姐姐)； d： 病例Ⅰ(家系一先证者)； e： 病例Ⅰ(家系一先证者)；

图4AXIN2基因片段测序结果

本研究对所有病例测序结果显示：AXIN2基因外显子2、外显子6和外显子11中的5个多态性位点可能与先天缺牙有关，病例Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ外显子2的第264位点A→G，密码子由ACA→GCA，苏氨酸变为丙氨酸；病例Ⅰ、Ⅳ外显2第547位A→G，密码子由CAA→CGA谷氨酰胺变为精氨酸；病例Ⅰ、Ⅳ外显子6第162位C→T，密码子CCG→CTG，脯氨酸变为亮氨酸；病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ外显子11第922位T→G，密码子GAT→GAG，天冬氨酸变为谷氨酸；以上4个位点均发生错义突变；病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ外显子11第1 141位T→A，密码子ACT→ACA，发生同义突变，仍编码苏氨酸。国外曾有外显子2的第264和第547位、外显子6的第162位和外显子11的第1 141位点可能导致先天多数牙缺失的报道[16-17]，而外显子11的第922位点还未见相关的研究报道。错义突变改变了编码的氨基酸,极有可能导致牙齿的异常发育；而同义突变也有可能影响相关基因的表达, 尽管同义突变不改变氨基酸的名称, 但有可能影响其表达量，也可导致肽链的提前终止，极有可能影响蛋白的功能, 进而引起牙齿发育异常, 导致多数牙先天缺失[18]。

同时,从本研究测序结果可看出，病例的突变位点存在交叉，可能说明AXIN2导致先天缺牙的SNP多肽性位点间存在关联性，部分先天缺牙患者AXIN2的基因突变位点相同, 但缺牙的位置、数目等临床表现却不尽相同，说明了AXIN2不是先天缺牙的唯一致病基因, 其他相关基因(如PAX9、MSX1等)的基因缺陷都有可能引起牙先天缺失。根据家系系谱图分析可知3个先天缺牙家系均为常染色体显性遗传。家系患者Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ除口内第三磨牙缺失外也可见其它牙位的缺失, 但其基因检测结果却未发现异常位点,进一步说明了牙齿发育的复杂性。

在AXIN2检测到的多态性位点以及错义、同义突变, 表明人类的遗传与突变总是伴随发生的, 基因的多态性常在不同层面体现[19]。通过牙齿畸形表现型及牙位的不同，人们推测可能存在另一种机制造成牙齿发育不全[20]。Parkin等[21]对同一先天缺牙家系中各成员缺牙数目和缺牙牙位进行比较后发现其相互间有较大差异, 得出先天缺牙的发生不仅由遗传因素控制，环境和后天因素也对其起到重要作用的结论，而且基因的突变是否影响蛋白质的功能, 其功能可能还受到环境因素、种族、性别、分子调控网络等诸多因素的制约[22]。因此我们认为是否有除AXIN2之外的其他基因或是由多基因相互影响造成先天缺牙还有待进一步研究证实。

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