周修森 方永凯

河南省信阳市食品药品检验所，河南 信阳 464000

颈脑康丸为河南省信阳市中医院制剂室配制的口服制剂，由黄芪、鸡血藤、丹参、地龙、葛根、威灵仙、红花等十三味中药组成。具有益气活血，痛经活络的功效，临床用于治疗颈椎病、脑梗塞、脑血管病后遗症及血管性脑供血不足等。该制剂中黄芪为君药，本文以黄芪甲苷为指标成分，参考有关文献［1－5］，建立高效液相色谱－蒸发光散射检测 (HPLC－ELSD)法测定方中黄芪甲苷含量的方法，为该制剂的质量控制和评价提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2420 ELS检测器、Waters 2707自动进样器 (美国 Waters公司);METTLER AE－240电子分析天平 (梅特勒－托利多仪器有限公司);KQ－300型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);基因型1850D超纯水机 (重庆摩尔制水设备有限公司)。

1.2 材料 颈脑康丸 (河南省信阳市中医院制剂室，批号:20130518，20130611，20130706);黄芪甲苷对照品(批号:110781－200613，中国药品生物制品检定所);色谱纯乙腈 (河北四友卓越科技有限公司，批号:130615);水为自制纯化水;其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 反相高效液相色谱－蒸发光散射检测器检测，流动相为乙腈－水 (36∶64)，色谱柱为Agilent HCC18 Analytical(5μm，4.6mm ×250mm)，流速为 1.0 ml·min－1，漂移管温度为70℃，氮气流量为2.8L·min－1，柱温为25℃，进样体积为10μL，理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12h以上的黄芪甲苷对照品16.05mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(含黄芪甲苷 0.1605mg·ml－1)。

2.2.2 样品溶液［2－3］取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，超声40min(功率300W，频率50kHz)，过滤，滤渣用甲醇洗涤2次 (每次10ml)，洗液并入滤液，滤液浓缩至干，残渣加水15ml，微热使溶解，通过D101型大孔吸附树脂 (内径1.5cm，柱高12cm)，依次用水100ml、1%氢氧化钠100ml、水200ml、30%乙醇100ml洗涤，弃去洗涤液，再用95%乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例和工艺制备不含黄芪的空白制剂样品，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品溶液、样品溶液和阴性对照溶液，按“2.1项”下色谱条件实验，结果:样品溶液与对照品溶液一致，均在15.4min处出现黄芪甲苷峰，而阴性对照溶液在该位置处并没有峰出现，说明用本法处理样品制备供试液不产生假阳性干扰。色谱图见图1。

2.3.2 线性关系 在制备黄芪甲苷对照品溶液时，同时配制浓度为0.032、0.08、0.16、0.24、0.32mg·ml－1的系列对照品溶液，分别按2.1项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度的对数为纵坐标，峰面积值的对数为横坐标进行回归，线性回归方程为:y=0.6615x－3.9805(r=0.9999)。表明黄芪甲苷在0.032～0.32 mg·ml－1的范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1项”下配制的对照品溶液，重复进样5次，测得黄芪甲苷峰面积的平均值为63917，RSD=0.92%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一制备样品溶液 (批号20130518)，分别在0、1、3、5、8h进样测定，测得峰面积的RSD=1.16%(n=5)，表明样品溶液在8h内丹参素含量稳定。

2.3.5 重复性试验 取同批次样品 (批号20130518)，按“2.2.2项”下方法制备6份样品溶液，按“2.1项”下色谱条件分别测定，结果该批样品每10g中含黄芪甲苷的平均值为0.9129mg，RSD=1.71%(n=6)，表明所用方法重复性好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知准确含量的样品 (批号20130518)5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，再精密加入对照品溶液2.5ml，按“2.2.2项”下方法，平行制备6份供试液，依“2.1项”下色谱条件测定，计算加样回收率 (%)，结果见表1。试验结果表明，所采用的测定方法准确度高。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

2.4 样品含量测定 取颈脑康丸3批，分别按“2.2.2项”下方法制备样品溶液，每批平行做3份，依“2.1项”下方法测定，计算出每10g中黄芪甲苷的平均含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 样品溶液的制备 采用超声提取和柱洗脱纯化分离的方法制备样品溶液。超声提取技术利用高频电磁波穿透提取介质，到达物料内部维管束和细胞，产生的电磁场还可加速被提取成分向提取溶剂界面扩散，最大限度保证提取的质量［2］;提取液过滤后，通过D101树脂柱，经水、碱水、稀醇溶液洗涤纯化，乙醇洗脱，蒸干，甲醇溶解成供试品溶液。该方法提取效率高，操作简便，重现性好，避免了回流提取、水饱和正丁醇萃取分离的繁琐操作，缩短了检验流程，提高了工作效率，节省了人力物力。

3.2 检测方法的选择 黄芪甲苷在紫外光区属于末端吸收，吸收波长与所用溶剂甲醇的截止使用波长相近，受溶剂及其组分的影响，可靠性和灵敏度较低。参照中国药典2010年版一部［5］，采用通用性检测器－蒸发光散射检测器进行检测。

3.3 含量限度的确定 黄芪甲苷 (即黄芪苷IV)为羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，是中药黄芪的主要活性成分，在复方制剂中以黄芪为君药测定其黄芪甲苷含量作为质量评价指标是合理可行的;根据实验结果和处方中用量，拟定本品每10g含黄芪以黄芪甲苷 (C41H68O14)计，不得少于0.8mg。

［1］赵建邦，马潇．HPLC－ELSD测定补肺丸中黄芪甲苷的含量［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(14):89－90．

［2］李莉，谭蔚，马雪松．微波辅助提取黄芪甲苷的研究［J］．中药材，2007，30(2):234－236．

［3］邢婕，秦雪梅，张丽增．HPLC－ELSD法测定黄芪甲苷含量供试品溶液制备方法改进［J］．山西大学学报 (自然科学版)，2008，31(4):577－579．

［4］周修森，方永凯．HPLC法测定柴丹疏利胶囊中丹参素的含量［J］．西部中医药，2012，25(10):25－27．

［5］国家药典委员会．中华人民共和国药典 (一部)［M］．北京:中国医药出版社，2010:549．