李秀梅，郭 恋，梁智选，李 颖，郭立力，石 瑜，朱雅宁，王红军

（1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧业发展服务中心，天津 300384）

布鲁菌环介导等温扩增检测试剂盒的研制

李秀梅1，郭 恋1，梁智选1，李 颖1，郭立力1，石 瑜1，朱雅宁1，王红军2＊

（1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧业发展服务中心，天津 300384）

利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立布鲁菌的检测方法。通过对反应条件的优化，组装布鲁菌LAMP检测试剂盒，并对试剂盒的各项性能进行评价。结果显示，该试剂盒适用于布鲁菌的快速检测，在63℃条件下1h内可检出布鲁菌，其检测限达5copies／μL，特异性为100%，无假阳性和假阴性出现。反复冻融20次或－20℃下贮存1年，均不影响试剂盒的使用效果。对牛奶样品的检测结果显示，阳性检出率为3.33%，与奶牛布鲁菌病PCR诊断技术（NY／T1467－2007）的检测结果相符。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点，可满足大批量样品快速筛选的要求。

布鲁菌；环介导等温扩增；检测试剂盒；Omp25基因

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）引起的一种变态反应性人畜共患传染病，严重地威胁着多种动物和人的健康，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。我国农业部将其列为二类动物疫病，卫生部将其列为乙类传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病［1］。布鲁菌在自然环境中生活力较强，在病畜的分泌物、排泻物及死畜的脏器中能生存4个月左右，在食品中约生存2个月。羊、牛、猪是其主要宿主，羊、牛、猪及其畜产品与人类接触密切，从而增加了人类感染的机会，因此建立快速、准确的检测方法是保证人类和动物生命安全的重要手段。

目前，用于布鲁菌常规的检测方法有细菌分离培养、血清凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验和PCR等方法，但花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在基层生产中普及应用，因此，建立一种简单、快速、准确的病原诊断方法显得十分必要。Notomi T等［2］于2000年发明了环介导等温核酸扩增技术（LAMP），该技术依赖4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列。目前，对于LAMP研究多集中在检测方法建立阶段，真正建立有实际应用的LAMP检测试剂盒却鲜有报道。本研究旨在建立一种快速、准确检测布鲁菌的试剂盒并进行实际应用，为监测畜产品的生物安全及兽医临床快速准确地诊断布鲁菌提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

BstDNA聚合酶、EcoRⅠ限制性内切酶、Mg－SO4为纽英伦生物技术（北京）有限公司产品；DNA Marker、全血基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；Betaine Solution（甜菜碱）、钙黄绿素为SIGMA公司产品；布鲁菌弱毒疫苗（S2株）为中牧实业股份有限公司兰州生物药厂产品；胎儿弯曲菌、大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌菌株为广州粤晨生物科技有限公司提供；羊、牛、猪、犬种布鲁菌基因组核酸由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 采用引物设计软件Primer 4.0（http：／／primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan），针对布鲁菌保守的 Omp 25基因设计了4条LAMP的特异性引物，包括2条外引物（F3和B3）以及2条内引物（FIP和BIP）。引物由北京三博远志生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.2 阳性对照品的制备 将外引物PCR扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，克隆到载体pMD 19-T上，经PCR及测序分析后，提取质粒DNA作为阳性对照。测定其浓度，并计算其拷贝数。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.2.3 试剂盒的组装 试剂盒组成（48个反应／盒）。使用方法如下：①配制反应体系25μL／LAMP：2μL布鲁菌LAMP检测混合液1，3.5μL布鲁菌LAMP检测混合液2，7.5μL布鲁菌LAMP检测混合液3，1μLBstDNA聚合酶、补充无菌水至23μL，加入2μL待检样品或阴、阳性对照品。②在恒温水浴锅、恒温金属浴、PCR反应仪及浊度仪等可恒温设备上进行扩增，扩增反应条件：63℃恒温反应60min。

1.2.4 试剂盒检测参数的评价

1.2.4.1 特异性 将提取的布鲁菌（羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌）与非布鲁菌菌株（胎儿弯曲菌、大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌）基因组DNA各取2.0μL作为模板，用本研究研制的试剂盒进行检测。

1.2.4.2 灵敏度 将布鲁菌弱毒疫苗（S2株）DNA模板定量后分别进行10倍梯度稀释，各取2.0μL作为模板，用试剂盒进行检测。

1.2.4.3 重复性 采用本研究建立的试剂盒对羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌的基因组DNA分别进行3次重复检验。

1.2.5 稳定性试验

1.2.5.1 保存期 将本研究研制的试剂盒置于－20℃冷冻保存，每隔3个月取出3个不同批次的试剂盒各1盒，分别对试剂盒中的阴、阳性对照品以及羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌的基因组DNA进行检测。

1.2.5.2 反复冻融试验 将试剂盒由－20℃取出，置室温下溶解，再置－20℃冷冻，如此反复分别经冻融5、10、15、20、25次后，对试剂盒阴、阳性对照品进行LAMP扩增。

1.2.6 样品采集 牛奶样品为天津市奶牛养殖场产品，共采集60份。

1.2.7 临床样本检测 采集的牛奶样品共60份，使用全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用本研究研制的试剂盒进行检测，并与奶牛布鲁菌病PCR诊断技术（NY／T1467－2007）检测结果进行比较。

2 结果

2.1 重组阳性对照品的克隆测序

构建的试剂盒阳性对照经北京三博远志生物技术有限责任公司测序，序列大小为228bp，与设计一致。将此序列在NCBI中进行Blast比对分析，结果表明，该序列与GenBank上所有的布鲁菌Omp 25基因同源性大于98%。

2.2 特异性

选取布鲁菌LAMP引物分别对布鲁菌菌株（羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌）与非布鲁菌菌株（胎儿弯曲菌、大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌）的基因组DNA进行特异性检验。经LAMP试剂盒检测，羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌反应管为特异性绿色，其余反应管均为橙色，如图1所示。

2.3 灵敏度

应用试剂盒对布鲁菌弱毒疫苗（S2株）各个稀释度基因组DNA提取液进行检测后，如图2所示，稀释度为101～106倍时，反应管均显示特异的绿色，107稀释度和空白对照管均为橙色。按拷贝数计算，该试剂盒最低检测限可达到大约5copies／μL的水平。

2.4 重复性

以羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌基因组DNA作为模板进行3次重复性检测，反应管均呈特异的绿色，而阴性对照反应管均呈橙色，表明该试剂盒具有良好的重复性。

2.5 稳定性

2.5.1 保存期 每隔3个月取出贮存于－20℃的3个批次的试剂盒各1盒进行LAMP检测，连续检测12个月。阴性对照反应管均呈橙色，阳性对照和羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌基因组DNA的反应管均呈特异性绿色。该试剂盒可在－20℃下保存1年。

图1 特异性试验结果Fig.1 The results of specificity test

图2 试剂盒灵敏度测试Fig.2 The sensitivity test of the kit

2.5.2 反复冻融试验 试剂盒反复分别经冻融5、10、15、20、25次后，对试剂盒阴、阳性对照品进行LAMP扩增，阴性对照反应管均呈橙色，阳性对照反应管均呈特异性绿色，该试剂盒具有良好的稳定性（图3）。

图3 试剂盒稳定性测试Fig.3 The stability test of the kit

2.6 临床样本检测

应用该试剂盒通过对60份牛奶样品进行检测，有2份样品中检出布鲁菌，检出率为3.33%，与奶牛布鲁菌病PCR诊断技术（NY／T1467－2007）检测结果完全一致，但比奶牛布鲁菌病PCR诊断技术（NY／T1467－2007）更快速和简便。

3 讨论

应用LAMP技术等核酸分子生物学技术建立布鲁菌特异性鉴定方法，靶基因的选择和引物设计优劣至关重要。本研究选择的Omp25基因在布鲁菌属种间有很高的同源性，并且Omp25基因是布鲁菌重要的毒力基因［3－6］。因此，本研究利用布鲁菌Omp25基因设计引物，经Blastn和Clustal W比对分析，在理论上保证其特异性并位于Omp25基因保守区段，再经对实际菌株样本检测进一步验证，结果表明，本研究建立的LAMP试剂盒能特异性的检测和鉴定布鲁菌，与非布鲁菌（胎儿弯曲菌、大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌）无交叉反应，具有很高的特异性，能够有效的避免假阳性问题。

经灵敏度试验，本研究建立的布鲁菌LAMP检测试剂盒检测布鲁菌基因组DNA灵敏度达到5copies／μL，优于文献报道中邱昌庆等［7］建立的套式PCR技术检测布鲁菌灵敏度50cfu／mL，徐军等［8］建立的套式PCR检测乳中布鲁菌灵敏度40cfu／mL和张太翔等［9］建立的荧光定量PCR检测牛布鲁菌灵敏度50copies／μL；与文献报道中吴中华等［10］建立的复合探针荧光定量PCR检测布鲁菌灵敏度 10copies／μL 和高正琴等［11］建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌灵敏度9.3copies／μL相当。因此，本研究建立的试剂盒灵敏度高，能够用于低污染量的样品检测。通过重复性、稳定性等试验对本试剂盒的性能进行评价，本试剂盒定性准确、稳定性及重复性好，而且LAMP检测全过程（包括样品前处理）可在2h内完成，完全适合于布鲁菌的快速检测。另外，LAMP具有完全闭管检测，不需PCR后处理等优点，克服了常规PCR反应体系的不足［12］。所以，本研究建立的布鲁菌LAMP快速检测试剂盒适用于肉、奶、组织等多种样品中布鲁菌的快速初筛检测，而进一步优化，装配成试剂盒后，更能满足基层实验室大规模普查需要，有望得到进一步的推广和应用。

［1］李长友，李 明.动物布鲁菌病防治指导手册［M］.北京：中国农业出版社，2012.

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Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Kit for Detection ofBrucella

LI Xiu-mei1，GUO Lian1，LIANG Zhi-xuan1，LI Ying1，GUO Li-li1，SHI Yu1，ZHU Ya-ning1，WANG Hong－jun2

（1.TianjinAnimalDiseaseControlCenters，Tianjin，300402，China；2.TianjinAnimalHusbandryDevelopmentandServiceCenters，Tianjin，300384，China）

A loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for detection ofBrucellawas established.By optimization of the reaction conditions of LAMP，LAMP kit was assembled，meanwhile various performance were evaluated in this paper.The results showed that the kit was available to rapidly detectBrucella.TheBrucellacould be detected by the kit within 1hour at constant temperature of 63℃.Limit of detection was at the level of 5copies／μL and the specificity of the approach was 100%without any false negative or positive action.Besides，the kit worked well after being frozen-thawed for 20times or stored at－20℃for one year.The milk samples of the cows with brucellosis were detected with the developed method and PCR method，and the results showed that the coincidence rate of these two methods was 100%，postive detection rate was 3.33%.The detection kit developed in this study has good performances in specificity，sensiticity and stability etc and is suitable for the rapid screening of mass samples.

Brucella；loop-mediated isothermal amplification；detection kit；Omp25gene

S852.614

A

1007-5038（2014）07-0006-05

2014-01-02

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA101605）；天津市科技支撑计划重点项目（10ZCZDNC02800）

李秀梅（1976－），女，黑龙江依安人，高级兽医师，硕士，主要从事预防兽医学研究。＊通讯作者