李峰利，狄佳春，赵亮，陈旭升

1. 南京农业大学农学院，南京 210095；

2. 江苏省农业科学院，农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，南京 210014

陆地棉皱缩叶突变体基因wr3的初步定位

李峰利1，狄佳春2，赵亮2，陈旭升2

1. 南京农业大学农学院，南京 210095；

2. 江苏省农业科学院，农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，南京 210014

陆地棉皱缩叶突变体是本项目组自主发现的一种自然突变体。前期对其表型性状的观察发现该突变体的农艺性状有别于前人已报道的皱叶突变体；通过陆陆杂交世代群体对其遗传规律的研究表明，皱缩叶突变性状是受一对完全隐性基因wr3控制的质量性状。文章以皱叶突变自交系L037和海7124为亲本配置组合得到的海陆杂交F2为作图群体，利用本实验室遴选的平均覆盖棉花26对染色体上的234对SSR引物(每染色体相对等距离分布9对引物)，通过对双亲以及近等基因池的筛选，共得到12对多态性引物。用这些引物检测F2作图群体每个单株的标记基因型，经Join Map 4.0分析显示，位于Chr.21的引物BNL3279与目的基因连锁，二者间的遗传距离为28.7 cM。随后对Chr.21上的其他引物进一步筛选，共得到16对与目的基因连锁的标记，其中与目的基因距离最近的标记NAU3740的遗传距离为4.8 cM，另一侧标记cgr5428的遗传距离为10.4 cM。由此推定，皱缩叶突变体基因wr3在棉花第21染色体上。

陆地棉；皱缩叶突变体；基因定位；SSR；BSA分析法

皱叶突变体性状表现明显，表型稳定，受环境的影响较少，易于识别、分组和计数，在突变体库的构建和经典遗传学基因定位中具有重要作用。国外在 20世纪已有关于棉花皱叶突变体的报道。Harland[1,2]和Hutchinson等[3]分别在海岛棉和陆地棉中发现了“矮皱突变体”，突变体的皱叶性状与植株的矮化特征伴随发生，遗传分析表明，两个矮皱突变体均是受1对隐性基因控制的质量性状。Turcotte等[4]报道在Pima棉F3株系后代中发现1个受1对显性基因 Ru控制的皱叶突变体。Kohel[5]在陆地棉中发现另一种皱叶突变，遗传分析显示，该突变体受1对显性基因Crp控制。Dilday等[6]运用等位性与连锁测试分析了陆地棉一系列的叶型突变体，发现在第15染色体上的单基因位点皱叶(cr)和另2个复等位基因位点即带状叶(s)和叶脉融合突变(vf)紧密连锁。Turcotte等[7]报道在海岛棉栽培种PimaS-4中发现了一种叶片极度皱缩突变体，该突变受 1对隐性基因 wr1控制。之后，Turcotte[8]报道在海岛棉中发现第2个皱叶突变，该皱叶突变也受1对隐性单基因控制；研究显示该皱叶突变基因与早前报道的突变基因 wr1不等位，显示其为一个新突变，基因符号定为wr2。Kohel报道在陆地棉变种Rex中发现一种新的皱叶突变，该突变体活力很低，呈半矮生状态，表型性状在开花前呈现，且随着植株生育期的推进，叶片皱缩程度不断加强。遗传研究显示，该突变性状受1对单隐性基因rx控制[9]。

国内简桂良等[10]报道，1985年新疆生产建设兵团一农科所技术员发现 1株皱叶海岛棉，该海岛棉子叶较小，叶片变厚，第1、2片真叶不皱缩或轻微皱缩，叶片缺刻浅，第 3片真叶以后的叶片、叶肉全部皱缩。戴日春[11]在陆地棉新黄绿苗突变体浙12-12N的遗传鉴定中提到，用黄绿苗突变体与浙农皱缩叶突变体等材料杂交，但没有更多关于浙农皱缩叶突变体的后续深入研究报道。陈旭升等[12]报道在陆地棉中发现一个新的皱叶突变体，该突变体成熟植株的株高比正常叶植株还要略高，皱叶性状约从第8片果枝叶开始表达，而后从下到上逐渐明显，直至生育期结束，这与Turcotte在海岛棉中报道的2个皱叶突变在表达时序上存在明显的差异。采用陆陆杂交群体遗传研究显示，该突变体是受一对隐性基因控制的质量性状；为区别 Turcotte报道的皱缩叶，拟将其基因符号定为wr3。

迄今关于棉花皱缩叶突变体的公开研究报道多局限于经典遗传学方法进行遗传分析与连锁测验，仅明确这些突变性状的受控基因是单基因还是双基因、显性还是隐性基因。关于皱叶性状的基因定位报道较少。本研究拟采用SSR分子标记技术，对陆地棉 wr3基因进行染色体初步定位，旨在为进一步的精细定位和克隆奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以正常叶海岛棉品种“海7124”为母本，陆地棉皱缩叶突变体自交系“L037”为父本进行杂交获得F1。然后以F1自交获得的F2分离群体为作图群体，用于皱缩叶基因wr3的初步定位。

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增及产物检测

所有亲本和群体单株的DNA提取参考Paterson等[13]方法。利用本实验室遴选的多态性较好且平均覆盖棉花26对染色体上的234对SSR引物(每染色体相对等距离分布9对引物)，参照张天真等[14]的方法进行PCR扩增。PCR反应在PTC-200(MJ research)上进行。扩增结束后，产物经恒压 200 V 非变性PAGE凝胶电泳，凝胶浓度8%～10%，电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后，参照张军等方法进行染色[15,16]。1.2.2 目的基因的染色体定位

在F2群体中随机选取皱缩叶植株和正常叶植株各10株，用scandrop250超微量核算蛋白测定仪测定各DNA的浓度，统一稀释成40 ng/μL后，吸取等量的DNA分别混合，作为近等基因池。利用234对引物对作图亲本和F2近等基因池进行 PCR 扩增，筛选出具有多态性的引物。然后，用多态性引物检测 F2群体150个单株的标记基因型，连锁分析得到与目的基因连锁的引物，从而锁定目标染色体。合成目标染色体上的SSR引物进行加密，以实现目的基因的初步定位。

统计多态性条带，与皱叶L037带型相同的个体记为“1”，与海7124带型相同的个体记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”。然后，进行 χ2适合性测验，验证标记分离比例是否符合孟德尔遗传规律。利用 JoinMap 4.0[17]进行连锁分析，LOD值为3，用Kosambi 作图函数计算标记间的遗传距离(cM)。

2 结果与分析

2.1 皱缩叶突变体的表型特征及其F2群体分离规律

皱缩叶性状在苗期不表现，该突变性状出现的时间约在第 8果枝叶后，在初花期表达明显，而后出现的其他果枝节位均表现为皱叶，而且由下到上叶片皱叶性状表达逐渐明显。皱叶会导致部分叶片局部失绿，有些叶表面表现类似烫伤的皱缩状，表面有泡状突起，部分叶片加厚呈革质状(图1)。

图1 皱缩叶突变体不同果枝叶的表型特征叶片编号由 1到 10，代表同一棉株由下到上不同果枝叶的表型特征。1、2为第8果枝叶之前的正常叶片，3～10为第8果枝叶以后的皱缩叶片。

在皱缩叶性状明显表达的初花期，对海7124与L037杂交的F2群体表型性状进行统计。结果显示，F2群体共计 150株，其中表现皱缩叶性状的隐性个体共43株，正常叶个体共107株。卡方适合性测验结果显示，杂交 F2的分离拟合正常叶:皱缩叶=3:1的分离比例(χ2=0.334＜χ20.05,1=3.84)，符合孟德尔遗传规律。以上结果表明，皱缩叶突变体是受1对完全隐性基因控制的质量性状。与本项目组前期在陆地棉中的研究结果一致[12]。

2.2 SSR标记的多态性筛选和目的基因wr3的染色体定位

利用234对引物对亲本皱叶L037和海7124进行 PCR 扩增，最终获得了 169对多态性引物，多态率为72.22 %。依据BSA法，采用上述引物对F2近等基因池进行二次筛选，共得到12对多态性引物，多态率为3.13%。

以这12对多态性引物检测 F2作图群体每个单株的标记基因型，对电泳条带的数据做连锁分析，结果显示共显性标记BNL3279与目的基因连锁，两者间的遗传距离为28.7 cM。对照Zhao等[18]发表的高密度棉花遗传图谱，标记BNL3279位于Chr.21(D11)上。随后合成了该染色体目标区段的SSR引物，通过对亲本的筛选得到24对多态性引物。以这些引物检测F2作图群体每个单株的基因型并做连锁遗传分析，结果显示，共有16对SSR标记与目标基因wr3发生连锁，它们分别为标记 BNL2895、NAU4026、NAU4855、NAU0984、Gh132、NAU6315、BNL3279、CIR077、 NAU6697、 NAU6593、 NAU6658、NAU3740、cgr5428、BNL2650、NAU2016和NAU429(图2)。其中，标记NAU3740与目的基因的遗传距离4.8 cM，另一侧标记cgr5428与目的基因的遗传距离为10.4 cM，由此推断，皱缩叶突变体基因wr3在棉花Chr.21(D11)上。

3 讨 论

由于突变体在作物遗传、品种改良、基因定位、基因分离与鉴定以及基因表达与调控等研究中均具有重要的意义，因此构建和筛选突变体库显得尤为重要，并成为国内外研究的热点。拟南芥大规模突变体库中已包含22 5000个T-DNA插入突变体[19]，水稻中也有超过20 0000个插入标签侧翼序列[20]。相对于拟南芥和水稻，棉花突变体库的构建仍处于初级阶段。

自然突变具有不定向、突变谱广等特点，是获得突变材料的重要途径，可以为突变体库的构建提供重要原始材料。目前已正式鉴定的异源四倍体棉花质量性状基因约计200个(包括重叠基因)，其中包括红株、亚红株、植株矮化等各种突变型[21～23]。异源四倍体棉种的质量基因连锁群见诸报道的有 18个，其中12个已经与特定的染色体相联系，分别是第 1、3、4、5、6、7、12、15、16、18、20和 26染色体[24]。

图2 皱缩叶突变体基因wr3的连锁图谱A：为Zhao等已发表的海陆种间Chr.21遗传图；B：为皱缩叶突变体基因wr3的定位连锁图。

本研究以陆地棉中自主发现的皱缩叶突变体为实验材料，利用SSR分子标记技术，成功地将 wr3基因定位在NAU3740和cgr5428之间，从分子遗传学水平将目标基因定位在棉花Chr.21(D11)上。该研究成果有两方面科学意义：(1) 目标性状的成功定位可以为棉花第 21染色体质量性状基因连锁群的构建提供一个新路标。该皱缩叶突变体作为一个新的形态学标记可用于棉花突变体库的构建，突变体本身也可以作为对性测验和连锁测验的遗传材料被利用；(2) 目的基因的成功定位可为未来对该基因的精细定位与克隆提供参考依据，也可为控制皱缩叶性状的关键基因的挖掘、分离和功能分析及其生理生化机理的研究提供科学指导。

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(责任编委: 李付广)

Mapping of a new wrinkled leaf (wr3) gene in upland cotton

Fengli Li1, Jiachun Di2, Liang Zhao2, Xusheng Chen2

1. Agronomy College of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Key Laboratory of Cotton and Rape in the Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China

The phenotype of a wrinkled leaf mutant in upland cotton newly found was different from other analogous mutants reported previously. Genetic analysis indicates that the mutation is controlled by a single recessive gene wr3. In this paper, an F2mapping population derived from the mutation inbred line L037 crossing with Hai7124 (Gossypium babardense) was used. A total of 12 pairs of polymorphic primers were selected from 234 pairs of SSR primers obtained before, which covered 26 pairs of cotton chromosomes at regular intervals. Genetic mapping of the F2population showed that gene wr3was linked to the primer BNL3279 on Chr.21 with the distance of 28.7 cM. Further screening of other primers on Chr.21 showed that gene wr3was flanked by the primers NAU3740 and cgr5428, with genetic distance of 4.8 cM and 10.4 cM, respectively.

Gossypium hirsutum; wrinkled leaf mutant; gene mapping; SSR; bulked segregation analysis

2014-06-04;

2014-08-26

转基因生物新品种培育科技重大专项子课题(编号：2011ZX08005-001)和转基因特色专用棉新品种培育项目(编号：2011ZX08005-005)资助

李峰利，硕士研究生，研究方向：棉花分子遗传育种。E-mail: 776840727@qq.com

陈旭升，研究员，研究方向：棉花遗传育种。E-nail: njcxs@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1256

时间: 2014-9-28 14:30:04

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140928.1623.005.html