付绍印，赵宏丽，郑竹清,2，李金泉,2，张文广,2,3

1. 内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；

2. 动物遗传育种与繁殖内蒙古自治区重点实验室，呼和浩特 010018；

3. 内蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特 010020；

4. 内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010031

褪黑激素对绒山羊皮肤中毛囊周期相关miRNAs表达模式的影响

付绍印1,2,3,4，赵宏丽1，郑竹清1,2，李金泉1,2，张文广1,2,3

1. 内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；

2. 动物遗传育种与繁殖内蒙古自治区重点实验室，呼和浩特 010018；

3. 内蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特 010020；

4. 内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010031

褪黑激素(Melatonin, MT)和miRNAs在毛囊的生长发育过程中发挥重要的作用，但MT对绒山羊皮肤毛囊miRNAs表达模式的影响尚未见报道。为探索MT从miRNAs层次影响山羊绒生长的机制，文章在内蒙古绒山羊中实施了褪黑激素埋植试验：5只青年母羊作为实验组埋植褪黑激素，另外5只青年母羊作为对照。利用荧光定量PCR检测褪黑激素埋植前后毛囊周期相关miRNAs的表达变化。结果表明，埋植MT明显改变了6个绒毛相关miRNAs的表达规律：在一个绒毛周期内，除let-7a外，miR-203、miR-205、miR-96、miR-183和miR-199a的表达量均发生3次跃迁；埋植MT改变了miRNAs之间的共表达模式。对照组各miRNA之间相关系数范围为 0.87～0.99(P＜0.01)。与对照组相比，埋植组中 let-7a与 miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203与miR-96、miR-199a，miR-96与miR-183，miR-183与miR-199a之间的相关系数被明显消弱；MT通过下调6月份埋植组各miRNA的表达量提早诱发二次生绒。

褪黑激素；miRNAs；绒山羊；绒毛周期

动物的被毛生长是一个极其复杂的过程，受营养、环境、代谢水平以及基因表达调控等诸多因素的影响[1]。褪黑激素(Melatonin, MT)和miRNAs在毛囊的生长发育过程中发挥重要的作用。MT是高度保守的吲哚类激素，对多种细胞、组织和器官有非常重要的作用[2]。研究表明，皮肤组织是除松果体外，MT合成与代谢的又一重要场所[3,4]。外源MT能诱发水貂(Mustlavison)、狐(Vulpes)、毛丝鼠(Chinchilla)、安哥拉兔(Angora)提早长毛[2,5～7]，促进休止期向生长初期毛囊转变、延长生长初期、抑制生长中期转变等[8]。对绒山羊(Capra hircus)的研究也发现，MT能提高绒毛产量，诱发二次生绒，提前毛囊生长期[9～11]。但由于绒山羊皮肤组织没有膜受体MT1、MT2的表达[12]，因此，对MT促绒生长的分子机理尚未见详细报道。miRNAs是近年来发现的一类在转录后影响基因表达的调控因子，参与细胞的增殖、凋亡及个体的生长、发育等几乎所有的生命过程。关于miRNA在皮肤毛囊发育过程中的重要作用也有许多相关报道，包括参与皮肤毛囊形态建成、毛囊周期性生长等过程。2006年，Yi等[13]通过构建表皮特异性 K-14启动子条件性敲除了小鼠皮肤祖细胞中合成miRNAs的Dicer酶；敲除Dicer酶的小鼠出生后表型基本正常，但1～2 d体重开始下降，4～6 d产生明显脱水，胡须发育畸形；镜检发现在毛囊形成过程中毛囊基质不向内陷，而是外翻，影响了毛囊的正常形态发生。最近，陈玉林等[14]通过Solexa高通量测序发现，绒山羊绒毛生长的兴盛期、褪行期、休止期存在特异表达的miRNAs，提示miRNAs对毛囊生长和发育发挥重要的功能。因此，本研究在实验室前期工作的基础上，以内蒙古白绒山羊为研究对象，持续埋植MT，时间为1年，选取miR-203、 let-7a、miR-199a、miR-96、miR-183、miR-205等6个毛囊周期相关的miRNAs，通过荧光定量PCR分析埋植MT前后这些miRNAs的表达变化，以期从miRNAs水平探讨MT促绒生长的分子机理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品

样品来自内蒙古农业大学动物遗传育种与繁殖重点实验室保存的2008年8月份至2009年7月份采自内蒙古白绒山羊种羊场的皮肤样品。

1.1.2 动物饲养以及样品收集

相同饲养条件下，根据绒长、绒细、产绒量、体重，选取体况良好的10只周岁母羊，随机平均分成两组，一组埋植MT，一组作为对照。MT埋植期间，每两个月按照2 mg/kg的剂量在绒山羊耳后皮下埋植MT，次月于肩胛部采集1 cm2大小的皮肤样品，液氮快速冷冻带回实验室，-80℃保存备用。同一日期夜间12点左右于静脉处采集血液样品。

1.2 方法

1.2.1 血液中MT含量测定

将肝素钠抗凝的新鲜血液样品2500 r/min离心12 min，抽取上层血浆，用MT放免试剂盒(KIPL3300，Biosource公司)测定血液中的MT浓度。

1.2.2 绒山羊皮肤组织miRNAs的提取及反转录

皮肤组织 miRNAs提取和分离按照 miRcutemi-RNA提取分离试剂盒(DP501，TIANGEN BIOTECH CO., LTD)说明书进行。提取的小RNA用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，微量紫外分光光度计测定其浓度，小RNA溶液在-80℃保存备用。OD260/280值在1.8～2.0之间、大小在200 nt以下的小RNA样品用于后续miRNAs反转录合成。

表1 miRNAs定量引物序列

miRNAs cDNA合成按照 TaKaRa公司的 One Step PrimeScript进行。反转录体系为20 μL，包括2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL、0.1%BSA 2 μL、miRNAPrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL、小RNA 100 ng，用ddH2O补足到20 μL。反应条件：37℃60 min；85℃ 5 s。将合成的miRNA第一链cDNA稀释成100 μL，-20℃保存备用。

1.2.3 miRNAs的荧光定量引物

参照miRBase19.0山羊、绵羊、牛成熟miRNAs序列，利用primer5.0设计候选miRNAs以及内参5S rRNA定量引物，序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表1。

1.2.4 miRNAs荧光定量分析

以反转录得到的miRNAs cDNA为模板，利用ABI MP3005 Real-time PCR 系统(ABI,USA)，参考SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)试剂盒说明书，采用二步法进行Real-time PCR扩增。扩增条件：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，复性(温度见表1)45 s，40个循环；94℃ 30 s，55℃ 30 s至95℃ 30 s连续扫描，0.5℃作为一个梯度，扫描 0.06 s。反应体系为20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM10 μLⅡ 、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL。

1.2.5 统计分析

候选 miRNAs表达水平的计算按照内参基因的ΔCT法进行，即相对表达水平=2△CT，其中△CT=CT内参基因- CT目的基因。

SAS9.0软件TTEST过程分别对各个miRNA埋植组与对照组不同月份的表达量进行差异显著性检验。各组内miRNA表达量的相关性分析采用CORR过程。

2 结果与分析

2.1 血液中MT的变化

绒山羊一个绒毛生长周期内夜间血浆中MT的水平如图1所示。结果表明，对照组血浆中MT水平在7～30 pg/mL之间，而埋植组血浆中MT平均浓度高达150.77 pg/mL，平均高出对照组10.4倍。

2.2 埋植MT后绒毛生长变化

图1 夜间血浆中MT含量(pg/mL)

图2 各月份羊绒长度

每月剪取受试羊群体侧肩胛部绒毛样品，测定绒毛长度，观察分析绒毛变化(图2)。埋植MT后绒毛长度变化并不显著，但伴有提早二次生绒的现象(6月埋植组绒毛提前长出体表2～3 cm)，5月为抓绒期，无绒毛长度记录。

2.3 绒毛生长相关miRNAs在绒山羊皮肤组织中的表达

选取5S rRNA为内参基因，埋植组与对照组各miRNA不同月份的相对表达量见表2，变化规律见图3。

埋植MT各候选miRNA均发生了显著的变化(P＜0.05)。埋植MT后miR-203在9、10、12、2、3、4、5、7月的表达量显著升高，let-7a的表达量在9、12、2、3、4、7月发生了显著上调，miR-205的表达量在9、10、2、3、4、7月显著升高，miR-96则是 10、2、3、4、7月显著上调，miR-183和miR-199a除9、3、4、7月发生显著共同上调外，miR-183在12、2月以及miR-199a的10月也发生了明显升高；而所有6个miRNAs均在11、1、6月发生显著降低，另外miR-183在8月以及miR-199a在12月也发生了显著降低；其他月份变化不明显(P＞0.05)。

对照组中，除miR-199a外，miRNAs的表达量均是8、9月基本保持不变，10月开始上升，11月达到全年的最高峰，然后缓慢下降，在2、6月又出现两个微小的波峰，miR-199a除12月达到全年最高峰外，规律与其他miRNAs基本一致；埋植组中，miR-203、miR-205、miR-183自MT埋植以后就开始缓慢上升，并在全年内出现 3个明显的表达波峰，分别是10、12、2月，所不同的是miR-183全年处于较低水平。let-7a在绒毛生长的一个周期内，其表达规律与 miR-203、miR-205、miR-183基本一致，只发生了微小的变化：埋植MT以后，从8月到12月一直缓慢上升，1月急剧下降后 2月又快速升高达到全年的最高点，然后急剧下降并一直保持较低水平。miR-96、miR-199a埋植MT以后均是将全年的表达最高峰提前到10月，另外在12月、2月也出现了小的波峰。

总之，除let-7a外，MT使miR-203、miR-205、miR-96、miR-183、miR-199a的表达跃迁点发生了3次变化。

2.4 埋植组和对照组内各miRNA相关性变化

利用SAS分析两组各miRNA间的相关系数，结果见表3。从表3可以看出，对照组各miRNA之间相关系数范围为 0.87～0.99(P＜0.01)，说明绒毛生长的不同时期各个 miRNA具有非常相似的表达模式。与对照组相比，埋植MT明显消弱了let-7a与miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203与miR-96、miR-199a，miR-96与miR-183，miR-183与miR-199a之间的相似性(P＞0.05)，这提示MT可能是通过降低绒毛相关miRNAs的协同作用进而影响绒毛生长周期。埋植前后各miRNA相关性网络变化见图4。

2.5 miRNAs表达变化与提早生绒的关系

6月处于绒毛生长的前期，毛囊活性刚刚启动，没有绒毛长出体表。然而埋植MT改变了这种生长模式，提早诱发二次生绒。本研究结果表明，埋植MT后，miR-203、let-7a、miR-205、miR-96、miR-183、miR-199a的表达量分别为对照组的 1/5、1/6、2/9、1/4、1/5、4/9，提示MT通过下调这些miRNAs的表达进而提前诱发绒毛生长。

3 讨 论

图3 miRNAs在不同实验组绒山羊皮肤中的变化规律

表3 埋植组和对照组各miRNA间相关系数

图4 埋植前后相关性网络变化图细线表示埋植改变的miRNA相互关系，粗线表示埋植未改变的miRNA相互关系。

国内外的研究均表明，MT作为诱因能够促进绒毛的生长，提高绒产量，而miRNAs作为一类新的转录后调控因子在皮肤毛囊周期发育过程发挥重要的作用。这就预示二者之间以相互联系的方式共同作用于皮肤毛囊周期，进而影响绒毛生长，然而关于MT对皮肤毛囊miRNAs表达模式的影响尚未见报道。本研究通过外源埋植MT，分析皮肤毛囊及绒毛周期相关miRNAs的表达规律，结果表明，埋植MT明显增加了夜间血液中MT的含量，显著改变了候选miRNAs的表达规律，这说明MT可以以miRNAs为介导转录后调控皮肤毛囊及绒毛周期。绒山羊次级毛囊周期为 1年。经典的毛囊周期划分为：4～11月份为生长期，12～1月份为退行期，2～3月份为休止期[15]，其中5～8月为次级毛囊生长前期，绒毛缓慢生长，9～11月为毛囊生长期，绒毛快速生长，11月绒毛生长最快。而从对照组miRNA的表达规律分析发现，各miRNAs 4～8月均处于较低水平，9～11月开始缓慢升高，11月到达全年最高水平，然后缓慢下降，在 2月出现另一个小的峰值。这就表明miRNAs的表达对绒毛周期的转换发挥至关重要的作用，为我们通过miRNAs来研究MT促绒生长提供了理论依据。

Let-7是最早被发现的miRNA之一[16]，它广泛参与调控动植物的时序发育。let-7的表达具有时间特异性，当细胞开始分化时，let-7的表达量开始迅速增加[17]。目前已有许多let-7 miRNAs参与动物组织器官发育调控的报道；miR-203是一类角质化细胞特异的miRNA[18]，它在抑制细胞的增殖、促进细胞的终末端分化方面发挥重要的调控作用；miR-96作为miR-183家族成员之一，与miR-183以共转录的方式共同调控细胞的增殖与分化；miR-199a在肾脏癌中通过靶向 GSK-3β控制细胞的增殖[19]。因此，从miRNAs功能的角度来看，这些miRNAs可以通过协同的方式调控细胞的增殖与分化。在这次研究中，通过实时荧光定量PCR发现，正常的绒毛周期内，同一月份各miRNA的表达量虽然存在变化，但全年内的变化规律基本一致，即 4、5、6月表达量保持较低水平并缓慢上升，在 7月出现一个突然下降后，再次升高，8、9月基本保持不变后开始急剧上升，于 11月到达全年的最高水平后快速下降，2月出现又一个高峰后，3月到达全年最低水平。这种miRNAs表达模式的相似性通过对照组各miRNA之间的相关性分析也得了证实(对照组各miRNA之间相关系数范围为0.87～0.99，P＜0.01)。然而，埋植MT明显改变了这种相似的表达模式。MT显著消弱了let-7a与 miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203与miR-96、miR-199a，miR-96与miR-183，miR-183与 miR-199a的相关性(表3)。人、小鼠、大鼠等的研究证实，miR-96、miR-183属于同一个miRNA家族，它们以共转录的方式调控细胞的增殖和分化。在山羊中，miR-96、miR-183的前体位于4号染色体1kb的基因簇中(miR-96，Chr.4：91111638-91111715；miR-183，Chr.4：91111879-91111980；)，因此山羊中 miR-96、miR-183可能也是以共表达的方式发挥作用，这在对照组中得到了证实(rmiR-96/miR-183=0.98，P＜0.0001)。埋植 MT明显改变了二者的相互关系，尤其是10月份，对照组二者表达量基本一致，但埋植MT后miR-96的表达量比miR-183高20倍左右，二者表达量比值的改变可能对绒毛生长发挥重要的调控作用。另外，在内蒙绒山羊的毛囊周期循环过程中，6月属于兴盛前期，毛囊活性刚刚启动，未见绒毛长出体表。然而，埋植MT改变了这种变化趋势，埋植组6月绒毛已经长出体表2～3 cm，而与之对应的是6月各miRNA的表达量均发生显著下调，因此表明在6月MT通过下调各miRNA的表达进而提早诱发二次生绒。

[1] 刘丹丹, 赫晓燕, 郝欢庆. MicroRNAs在动物皮肤和毛发发育中的调控作用. 中国生物化学与分子生物学报, 2010, 26(9): 802-808.

[2] Fischer TW, Slominski A, Tobin DJ, Paus R. Melatonin and the hair follicle. J Pineal Res, 2008, 44(1): 1-15.

[3] Fischer TW, Sweatman TW, Semak I, Sayre RM, Wortsman J, Slominski A. Constitutive and UV-induced metabolism of melatonin in keratinocytes and cell-free systems. FASEB J, 2006, 20(9): 1564-1566.

[4] Slominski A, Pisarchik A, Zbytek B, Tobin DJ, Kauser S, Wortsman J. Functional activity of serotoninergic and melatoninergic systems expressed in the skin. J Cell Physiol, 2003, 196(1): 144-153.

[5] 孔庆松, 刘志平, 景松岩, 张伟, 叶春艳 . 褪黑激素促进水貂冬皮早熟的研究. 野生动物, 1995, (4): 22-26.

[6] 王孝胜, 张志明, 毕全秀, 李春晖, 贾宏珍, 张峰. 埋植褪黑激素促进水貂生长、换毛、毛皮早熟的试验报告.毛皮动物饲养, 1995, (2): 3-5.

[7] 柳建昌, 尹协镇, 方天祺. 褪黑素对中国绒山羊在非生绒期促绒生长与绒产量的影响. 动物学杂志, 1998, 33(3): 8-12.

[8] Nixon AJ, Choy VJ, Parry AL, Pearson AJ. Fiber growth initiation in hair follicles of goats treated with melatonin. J Exp Zool, 1993, 267(1): 47-56.

[9] Fischer TW, Burmeister G, Schmidt HW, Elsner P. Melatonin increases anagen hair rate in women with androgenetic alopecia or diffuse alopecia: results of a pilot randomized controlled trial. Br J Dermatol, 2004, 150(2): 341-345.

[10] Kloren WRL, Norton BW, Waters MJ. Fleece Growth in Australian Cashmere Goats. III. The seasonal patterns of cashmere and hair growth, and association with growth hormone, prolactin and thyroxine in blood. Aust J Agric Res, 1993, 44(5): 1035 -1050.

[11] 常子丽. 持续埋植褪黑素对绒山羊绒毛生长特性和相关基因影响的研究[学位论文]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2010.

[12] Kobayashi H, Kromminga A, Dunlop TW, Tychsen B, Conrad F, Suzuki N, Memezawa A, Bettermann A, Aiba S, Carlberg C, Paus R. A role of melatonin in neuroectodermal-mesodermal interactions: the hair follicle synthesizes melatonin and expresses functional melatonin receptors. Faseb J, 2005, 19(12): 1710-1712.

[13] Yi R, O’Carroll D, Pasolli HA, Zhang ZH, Dietrich FS, Tarakhovsky A, Fuchs E. Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressed microRNAs. Nat Genet, 2006, 38(3): 356-362.

[14] Yuan C, Wang XL, Geng RQ, He XL, Qu L, Chen YL. Discovery of cashmere goat (Capra hircus) microRNAs in skin and hair follicles by Solexa sequencing. BMC Genomics, 2013, 14: 511.

[15] 李长青. 绒山羊毛囊周期性变化与兴盛期毛囊 KAP13-1基因的表达[学位论文]. 内蒙古农业大学, 2005.

[16] Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, Horvitz HR, Ruvkun G. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[17] Wulczyn FG, Smirnova L, Rybak A, Brandt C, Kwidzinski E, Ninnemann O, Strehle M, Schumacher S, Nitsch R. Post-transcriptional regulation of the let-7 microRNA during neural cell specification. FASEB J, 2007, 21(2): 415-426.

[18] Sonkoly E, Wei TL, Janson PCJ, Sääf A, Lundeberg L, Tengvall-Linder M, Norstedt G, Alenius H, Homey B, Scheynius A, Ståhle M, Pivarcsi A. MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis. PLoS ONE, 2007, 2(7): e610.

[19] Tsukigi M, Bilim V, Yuuki K, Ugolkov A, Naito S, Nagaoka A, Kato T, Motoyama T, Tomita Y. Re-expression of miR-199a suppresses renal cancer cell proliferation and survival by targeting GSK-3β. Cancer Lett, 2012, 315(2): 189-197.

(责任编委: 李明洲)

Melatonin regulating the expression of miRNAs involved in hair follicle cycle of cashmere goats skin

Shaoyin Fu1,2,3,4, Hongli Zhao1, Zhuqing Zheng1,2, Jinquan Li1,2, Wenguang Zhang1,2,3

1.College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018, China;
3. Institute of ATCG, Nei Mongolia Bio-Information, Hohhot 010020, China;
4. Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China

Melatonin and microRNAs (miRNAs) play important roles in regulating hair follicle development. However, the effect of melatonin on the expression pattern of miRNAs in skin and follicle of cashmere goats remain largely undefined. To explore the mechanism of melatonin affecting cashmere growth mediated by miRNAs, the effect of melatonin implants administered in Nei Mongol cashmere goats was assessed. In the experiment, five yearlingdoes were implanted with melatonin, with the remaining other five females as control group. The expression of six candidate miRNAs was quantified by reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results indicated that melatonin significantly altered the expression pattern of miRNAs. Except for let-7a, the expression levels of miR-203, miR-205, miR-96, miR-183 and miR-199a occur three transitions during a cashmere cycle; melatonin changed the co-expression pattern of miRNAs. The correlation coefficient between miRNAs is 0.87-0.99 in control group(P＜0.01). Compared with the control group, the correlation coefficient between some miRNAs (let-7a and miR-96, miR-199a, miR-205;miR-203 and miR-96, miR-199a; miR-96 and miR-183; miR-183 and miR-199a) was significantly weakened in melatonin group. Melatonin might induce second growth of cashmere mediated by down-regulating the expression level of some miRNAs in June in melatonin implanted group.

melatonin; miRNAs; cashmere goats; cashmere cycle

2014-05-04;

2014-08-11

国家科技支撑项目(编号：2011BAD28B05)和国家自然科学基金项目(编号：31260538)资助

付绍印，博士研究生，专业方向：动物遗传育种与繁殖。E-mail: fushao1234@126.com

张文广，教授，博士生导师，研究方向：数量基因组学暨性状遗传机理。E-mail: atcgnmbi@aliyun.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1235

时间: 2014-9-28 14:34:24

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140928.1623.006.html