潘强,杨学军,高松,纪延伟,张文高

(1.山东省莱芜市人民医院、泰山医学院附属莱芜医院神经外科,莱芜 271100；2.天津医科大学总医院神经外科,天津 300052；3.天津医科大学附属肿瘤医院胰腺肿瘤科,天津 300060；4.山东省交通医院神经外科,济南 250031；5.河北省沧州市中心医院神经外科,沧州 061001)

·药物研究·

替莫唑胺耐药人脑胶质瘤细胞系U251/TR建立及耐药机制*

潘强1,杨学军2,高松3,纪延伟4,张文高5

(1.山东省莱芜市人民医院、泰山医学院附属莱芜医院神经外科,莱芜 271100；2.天津医科大学总医院神经外科,天津 300052；3.天津医科大学附属肿瘤医院胰腺肿瘤科,天津 300060；4.山东省交通医院神经外科,济南 250031；5.河北省沧州市中心医院神经外科,沧州 061001)

目的 建立替莫唑胺耐药人脑胶质瘤细胞系,探讨其耐药机制,以期为临床优化药物化疗方案提供参考。方法通过体外分步诱导方法使人U251胶质瘤细胞对替莫唑胺产生耐药,噻唑蓝比色法检测耐药指数及细胞存活率;采用Western-Blot、逆转录-聚合酶链免疫(RT-PCR)、免疫荧光、免疫组化法检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达变化,分析细胞耐药机制。结果历经8个月成功建立了对替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞U251/TR,在替莫唑胺初始浓度为0.25 μg·mL-1,终浓度为16.00 μg·mL-1培养液中,U251/TR细胞半数抑制浓度(IC50)为未经诱导的U251胶质瘤细胞的7倍(P=0.00),其耐药指数约为7.00;U251/TR细胞MGMT表达水平较未经诱导的U251胶质瘤细胞明显增加(P=0.00)。结论通过分步诱导方法于体外成功建立1株对替莫唑胺耐药的U251/TR细胞系。MGMT表达水平升高是导致U251/TR细胞对替莫唑胺耐药的主要机制。

替莫唑胺;神经胶质瘤;O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶;抗药性

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是颅内最常见的恶性肿瘤,占所有颅内肿瘤的12%～15%[1]。临床上主要采用以手术治疗为主,辅助放射治疗、化学治疗(化疗)及生物治疗的综合方案。高脂溶性、小分子和易于透过血-脑脊液屏障的烷化剂,是目前公认的治疗脑胶质瘤的标准化疗药物[2]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)属于第2代烷化剂化疗药物,为咪唑四嗪类衍生物,口服的生物利用度近100%,不经肝脏代谢,能迅速透过血-脑脊液屏障,直接在脑胶质瘤组织碱性环境中分解,生成活性物质5-(3-甲基三氮烯-1)咪唑-4-酰胺[5-(3-methyl-triazen1-yl)imidazole-4-carboxomide,MTIC],疗效佳,不良反应小,目前备受临床青睐。然而,肿瘤细胞内在或获得性耐药限制了烷化剂的临床应用效果,目前GBM患者平均生存时间只有12～15个月[1]。迄今多数研究业已证实,导致胶质瘤细胞对烷化剂耐药的机制与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)表达水平有关。笔者通过分步诱导法构建对TMZ耐药细胞,检测其耐药机制,以期为进一步研究耐药机制、克服耐药提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞系来源 GBM细胞系U251,购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所中国科学院细胞库,稳定传代10代后用于实验。

1.2 药品与试剂 TMZ由天津天士力医药公司提供。二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司。噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司。免疫试剂中Ⅰ抗工作液MGMT小鼠抗人单克隆抗体MT3.1(MAB16200)为Chemicon公司产品,Ⅱ抗工作液中辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(BA1038)由武汉博士德生物工程有限公司提供,小鼠β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；所有抗体工作浓度均为1∶1 000。聚偏二氟乙烯膜购自美国Millipore公司。实时-聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)相关试剂购自日本Takara公司,达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)购自北京索莱宝公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)由美国Hyclone公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及细胞耐药分步诱导 GBM细胞U251置于含体积分数为10%FBS的DMEM完全培养液中,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱、饱和湿度常规培养。TMZ溶于DMSO溶液,储存液质量浓度为100 mg·mL-1,细胞培养过程中DMSO浓度始终维持＜0.10%,以免影响细胞生长[3]。处于对数生长期的U251胶质瘤细胞制成细胞悬液1×105个·mL-1,常规培养24h后加入初始诱导剂量的TMZ 0.25 μg·mL-1,继续培养15～20 d,待细胞生长稳定后倍增药物诱导浓度,每一诱导浓度培养15～20 d, TMZ终浓度为16.00 μg·mL-1。每个月定时加入16.00 μg·mL-1TMZ溶液培养7 d,使TMZ耐药细胞系U251/TR的耐药性保持稳定。

1.3.2 MTT法检测U251胶质瘤耐药细胞(U251/ TR)耐药指数 将对数生长期U251胶质瘤耐药细胞(U251/TR)和U251胶质瘤细胞,按照接种浓度为每孔细胞3×103个接种于96孔培养板内,每一浓度设复孔6个,培养24 h后分别滴加5,50,100和500 μmol·L-1TMZ溶液[4],继续培养72 h；弃上清液,检测前4 h每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,继续原条件下培养4 h,弃去上清液,每孔再加入DMSO溶液150 μL以终止反应,振荡10 min,经Bio-Rad酶标仪检测每孔在波长570 nm下的吸光度(A)值,以490 nm为参考波长。按照耐药指数=半数抑制浓度(IC50) (U251/TR)/IC50(U251),计算U251/TR细胞耐药指数。

1.3.3 Western-Blot法检测MGMT蛋白表达 选择对数生长期的待检测的U251胶质瘤细胞5×106个进行Western-Blot检测。提取总蛋白后采用二喹啉甲酸法行蛋白浓度测定,上样量为50 μg,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳后转膜,膜封闭液室温封闭3 h后,滴加MGMT小鼠抗人单克隆抗体(Ⅰ抗)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Ⅱ抗)进行孵育；化学发光物按照比例(1∶1)混匀、加于聚偏二氟乙烯膜上,X线片适度曝光后进行β-肌动蛋白(β-actin)二次杂交,即70℃水浴洗膜30 min[Tris-HCl(pH 6.8)62.50 mmol·L-1,体积分数2%SDS,β-巯基乙醇100mmol·L-1],同法,以小鼠βactin单克隆抗体(1∶1 000)孵育后曝光,以β-action作为内参照物。采用Alpha Innotech凝胶成像仪检测结果,以FluoChem V2.0版软件计算各条带的平均A值。每个样本重复检测3次。

1.3.4 RT-PCR检测 采用Trizol法提取细胞总RNA,用NanoDrop ND-1000进行定量RNA浓度,逆转录为cDNA。MGMT(Genebank accession no.NM_ 002412)设计引物,forward,5'-CCTGGGAACAAGCGTGTCT-3'；reverse,5'-CTGGACAGCGGCTATGGC-3',产物236 bp。β-actin PCR引物序列:forward,5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'；reverse,5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3',产物315 bp。以逆转录合成cDNA为模板,在200 μL EP管中按下列顺序加入反应体系:Master Mix 10 μL,上下游引物混合物1 μL, cDNA溶液,纯化水,充分混匀各组分,反应体系为20 μL。MGMT反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30 s,52℃退火30s,72℃延伸30 s,40个循环, 72℃总延伸5 min。β-actin反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s, 36个循环,72℃总延伸5 min。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测。

1.3.5 免疫荧光检测 将肿瘤细胞消化成细胞悬液稀释成约1×104个·mL-1,培养24 h后4%多聚甲醛固定细胞30 min,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤后,1%牛血清清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)封闭30 min,一抗(1∶1 000稀释) 4℃过夜,洗涤后,荧光二抗(1∶1 000稀释)37℃孵育1 h。避光,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核20 min,封片。荧光倒置显微镜下观察并摄像。

1.3.6 免疫组化检测 按免疫荧光方式固定细胞,一抗、二抗处理细胞后,滴加链霉亲和素-生物素复合物溶液,37℃孵育20 min,3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)显色,苏木精复染,梯度脱水,封片显微镜下观察并摄像。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS16.0版统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,由Probit过程分析TMZ不同浓度梯度与细胞生长抑制率之间的关系；直线回归方程计算两组U251胶质瘤细胞各自的半数抑制浓度(IC50)；两样本均数间的比较行t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞耐药性检测 采用分步诱导法经过8个月成功建立对TMZ具有稳定耐药的U251/TR细胞。结果显示,TMZ对U251/TR细胞产生作用的剂量-反应曲线(图1)上移,经回归方程计算U251胶质瘤细胞IC50为(33.12±1.52)μmol·L-1,U251/TR细胞IC50为(220.87±2.34)μmol·L-1,U251/TR对U251胶质瘤细胞的耐药指数约为7,即U251/TR细胞对TMZ的耐受程度为U251胶质瘤细胞的7倍,二者差异有统计学意义(t=-116.54,P=0.00)。且U251/TR细胞经2个月无TMZ体外培养后,采用诱导终浓度进行刺激培养10 d,其耐药性仍维持5倍,并可于之后的传代培养过程中保持耐药性,表明该细胞耐药性稳定。

2.2 U251及U251/TR细胞MGMT表达变化 Western-Blot、RT-PCR检测结果显示,U251胶质瘤细胞不表达MGMT或呈低表达,U251/TR细胞MGMT表达水平明显升高,差异有统计学意义(P=0.00,图2)。检测U251及U251/TR细胞中MGMT表达情况发现, U251细胞无或弱荧光,而U251/TR细胞质呈绿色荧光(图3)。胞核为DAPI染色,呈蓝色；免疫组化法检测U251及U251/TR细胞中MGMT表达情况发现, U251细胞无着色,而U251/TR细胞呈棕黄色或褐色着色(图3)。以上结果说明U251/TR细胞中MGMT表达较U251细胞中明显增强。

图1 TMZ对U251细胞和U251/TR细胞的剂量-反应曲线Fig.1 Dose-response curve of TMZ on U251 and U251/ TR cells

图2 Western-Blot和RT-PCR检测U251细胞和U251/ TR细胞中MGMT的表达Fig.2 MGMT expression in U251 and U251/TR cells by Western-Blot and RT-PCR detection

3 讨论

A.U251细胞(免疫荧光法);B.U251/TR细胞(免疫荧光法);C.U251细胞(免疫组化法);D.U251/TR细胞(免疫组化法)图3 免疫荧光法和免疫组化法对U251细胞和U251/TR细胞中MGMT的检测结果(×200)A.U251 cells(immunofluorescence)；B.U251/TR cells(immunofluorescence)；C.U251 cells(immunohistochemistry)；D.U251/TR cells(immunohistochemistry)Fig.3 MGMT expression in U251 and U251/TR cells by immunofluorescence and immunohistochemistry(×200)

虽然目前神经外科影像、手术技术已经得到了长足发展,但是GBM的治疗效果仍不尽如人意。化疗自20世纪80年代开始作为对脑肿瘤的辅助治疗手段[5],在延长胶质瘤患者生存期方面发挥了重要作用。GBM的化疗药物一般选择脂溶性、小分子、易于透过血-脑脊液屏障的细胞毒性药物,其中,临床以亚硝脲类药物最受推崇。口服烷化剂TMZ以其确切的临床疗效,为GBM的化疗带来了希望,但肿瘤细胞内在的或获得的耐药性限制了药物的临床效果,其5年生存率＜9.8%。因此,阐明GBM细胞耐药机制并探讨其逆转方式,将对新药的研发,逆转耐药性,改善患者生存状态,优化临床化疗方案等具有重大意义,而耐药细胞系的建立是进行此类研究的基础。

在本研究中,笔者通过体外分步诱导的方法使人U251胶质瘤细胞暴露于不同浓度的TMZ中,历经8个月,成功地诱导了一株耐药指数约为7的耐药细胞系U251/TR。经免疫荧光法、免疫组化法、Western-Blot、RT-PCR对MGMT检测结果显示,U251/TR细胞表达MGMT,而U251胶质瘤细胞则不表达或极低表达MGMT(P＜0.01)。根据肿瘤细胞MGMT是否表达,可将其分为具有MGMT表达的Mer+表型细胞和缺乏表达的Mer-表型细胞[6]。本研究结果提示,经体外传代培养的U251胶质瘤细胞属于Mer-细胞,对TMZ敏感；而U251/TR细胞为Mer+细胞,对TMZ具有明显耐药性。胶质瘤细胞对TMZ耐药的可能机制之一为肿瘤细胞的固有耐药性所致,如同为胶质瘤细胞系中的T98G细胞即MGMT呈高表达,对TMZ耐药性明显。U251胶质瘤细胞系虽为Mer-细胞,但不排除在其群体中存在少量Mer+细胞,当采用分步给予TMZ时Mer-细胞被杀死,而少量Mer+细胞得以存活,并成为以后耐药细胞克隆生长的母体。HAMPSON等[7]则认为, MGMT的表达出现不是对Mer-细胞选择性杀伤的结果,而是由于在分步诱导下,原来处于表达关闭状态的MGMT基因重新表达的缘故。有学者认为,MGMT基因启动子区CpG岛的非甲基化是导致MGMT表达的原因[8]。但笔者的研究揭示MGMT基因启动子区CpG岛的甲基化状态与MGMT的表达无相关性,如肿瘤自身增殖、血管生成、侵袭、免疫调节过程中某些因素的改变可能也影响MGMT表达[1]。另外,野生型p53(wild-type p53,wt-p53)蛋白可能对MGMT表达起抑制作用[9]。也有学者持相反观点认为,突变型p53可能与MGMT表达减少和(或)基因启动子甲基化有关[10]。有研究发现核因子κB与MGMT表达呈正相关,其调控机制是独立于启动子甲基化的[10-11]。IDBAIH等[12]则认为染色体1p和19q的联合缺失(LOH)与MGMT失活相关。在本研究中,U251胶质瘤细胞在诱导培养过程中MGMT表达水平明显升高,但MGMT蛋白表达的确切调节机制尚需进一步研究。

由于TMZ主要通过DNA甲基化对肿瘤细胞产生毒性作用,而MGMT可以去除鸟嘌呤O6位加合的甲基使DNA得以复原,这一过程将消耗MGMT[6]。因此,在倍增TMZ的药物浓度后,MGMT可能被不同程度消耗,造成部分肿瘤细胞被杀死或杀伤,而耐药性强的细胞适应后恢复增殖,向进一步高耐药水平发展,所以分阶段适度递增TMZ浓度是细胞顺利产生耐药性的重要环节,这可能给临床优化化疗方案以提示。

本研究结果提示,通过分步诱导的方法可以成功地建立对TMZ稳定耐药的胶质瘤细胞系,MGMT表达升高是胶质瘤细胞对TMZ等烷化剂耐药的主要原因；TMZ耐药人脑胶质瘤细胞系成功建立,将为新药研发、耐药性逆转和临床药物化疗方案的优化奠定基础。在未来研究中,笔者将进一步研究其耐药机制、逆转耐药性方式及如何优化临床化疗方案等。

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.001

Establishment of a TMZ-resistant Human Glioma Cell Line U251/TR and the Mechanism of Drug-resistance

PAN Qiang1,YANG Xue-jun2,Gao Song3,JI Yan-wei4,ZHANG Wen-gao5
(1.Department of Neurosurgery, People's Hospital of Laiwu City,Laiwu Hospital Affilliated to Taishan Medical College,Laiwu 271100,China; 2.Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;3. Department of Pancreatic Neoplasms,Cancer Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300060,China;4. Department ofNeurosurgery,ShandongJiaotongHospital,Jinan250031,China;5.Departmentof Neurosurgery,Cangzhou Central Hospital of Hebei Province,Cangzhou 061001,China)

Objective To establish a drug-resistance cell line of human glioma with temozolomide(TMZ),investigate its resistance mechanisms,and provide experimental evidence for optimal TMZ therapy.MethodsA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ.Resistance index and cell viability were accessed by MTT assay.Western-Blot,RT-PCR,immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect MGMT expression for the analysis of resistance mechanism.ResultsA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was developed after 8 months of stepwise induction with 0.25-16.00 μg·mL-1TMZ.IC50in U251/TR cells was approximately 7 times higher compared with that in U251 cells(P=0.00).The MGMT expression was significantly increased in U251/TR cells compared with that in parental U251 cells(P=0.00).ConclusionA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ.The primary mechanism of TMZ resistance is associated with increased activity of MGMT.

Temozolomide;Glioma;O6-methylguanine-DNA methyltransferase;Drug-resistance

R979.1；R969

A

1004-0781(2014)09-1121-05

2013-09-09

2013-11-09

*国家自然科学基金资助项目(30772228)

潘强(1980-),男,山东莱芜人,主治医师,硕士,研究方向:神经上皮来源肿瘤。电话:(0)13561724411,E-mail:pqianglin@163.com。

杨学军(1965-),男,天津人,教授,博士生导师,博士,研究方向:神经上皮来源肿瘤。电话:(0) 13011329950,E-mail:ydenny@yahoo.com。