潘晓丽,熊永爱,谭玉柱,向晖

(成都中医药大学药学院,成都 611137)

马齿苋总黄酮对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1信号因子表达的影响

潘晓丽,熊永爱,谭玉柱,向晖

(成都中医药大学药学院,成都 611137)

目的 观察马齿苋总黄酮对肝纤维化大鼠转化生长因子(TGF)-β1基因及其蛋白表达的影响,探讨马齿苋总黄酮对肝纤维化的治疗作用机制。方法SD大鼠48只,随机分为正常对照组、模型对照组、复方甘草酸苷组、马齿苋总黄酮组,各12只。除正常对照组外,其余各组大鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)溶液2 mL·kg-1·d-1复制肝纤维化模型。复方甘草酸苷组灌胃复方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1,马齿苋总黄酮组灌胃马齿苋总黄酮溶液35.6 mg·kg-1,正常对照组和模型对照组灌胃等体积纯净水。30 d后麻醉处死动物剖取肝脏,实时-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-Blot法检测肝脏细胞TGF-β1基因及蛋白表达。结果正常对照组、模型对照组、复方甘草酸苷组、马齿苋总黄酮组大鼠肝脏细胞中TGF-β1基因的相对表达量分别为0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。马齿苋总黄酮可显著下调TGF-β1基因(P＜0.01)及TGF-β1蛋白(P＜0.01)的表达。结论马齿苋总黄酮可通过下调大鼠肝纤维化细胞TGF-β1基因及蛋白表达有效治疗肝细胞纤维化病变。

马齿苋总黄酮;肝硬化;转化生长因子

肝纤维化是指由多种慢性疾病引起的肝脏持续的创伤修复反应而导致的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积和肝脏功能的受损[1]。研究表明,多种细胞参与了肝纤维化的形成,其中激活的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是促进ECM过度沉积的主要细胞[2],而多种细胞因子参与了HSC的激活,其中转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)被认为是最关键的因素[3]。其可激活HSC和调节ECM的合成和降解平衡。以干扰TGF-β1及其细胞信号转导通路为靶点的抗肝纤维化治疗已成为当今研究的热点。

马齿苋(Portulaca oleraceaL.)又名瓜子菜,为马齿苋科马齿苋属植物,具有解毒、抗炎、利尿、镇痛功效。马齿苋富含黄酮、皂苷、生物碱等天然活性成分,具有多种药理作用,如抗菌、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗心血管疾病、增强免疫力等[4]。马齿苋黄酮是马齿苋中主要活性成分之一,具有降脂、抗血栓、抗氧化等药理活性,主要有槲皮素、山奈素、杨梅素、芹菜素、木犀草素等[5]。笔者尚未见关于马齿苋黄酮对肝纤维化病变的治疗或保护作用的报道,笔者在本实验中拟以马齿苋总黄酮为研究对象,通过对肝纤维化病变过程中肝细胞TGF-β1信号转导通路中的关键成员TGF-β1的干预,初步研究马齿苋黄酮预防肝纤维化病变的作用机制,为研究肝纤维化病变细胞TGF-β1信号转导通路中其他成员奠定基础,也为开发马齿苋肝靶向制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 斯波雷格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠48只,SPF级,雌雄各半,体质量180～220 g。由成都达硕生物科技有限公司提供,动物合格证号:SCXK (川)2008-24。使用许可证号:SCXK(川)2009-124。饲养环境:温度(22±3)℃,湿度(55±5)%。

1.2 药物与试剂 马齿苋总黄酮(自制)。阳性药:复方甘草酸苷,日本米诺发源制药株式会社秋山片剂株式会社生产,批号:20121014。RNAiso Plus Kit,批号:BK3303；PrimeScript RT reagent Kit,批号:BK501；SYBR Premix Ex Taq II Kit,批号:BK402,均购自大连宝生物工程有限公司。二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)；蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所,批号:P0015)；聚丙烯酰胺凝胶电泳预染蛋白MAKER(美国FERMENTAS公司,批号:SM0441)；TGF-β1兔抗鼠一抗(Cellsignalling公司,批号:9103)。四氯化碳溶液(Sigma公司,纯度＞99.9%,批号:S1272-03-9)。

1.3 仪器 电子天平(BS-600L,上海友声衡器有限公司)；实时-聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增仪(PIKORed96,美国ThermoFisher仪器有限公司)；匀浆机(DY89-I,宁波新芝生物科技股份有限公司)；垂直电泳槽(UK-33,美国Bio-RAD公司)；电泳仪(DYY-6C,北京六一仪器厂)；化学发光凝胶成像仪(美国Bio-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组与给药 SD大鼠48只,随机分为4组,每组12只,分别为:①模型对照组:给予等体积纯净水；②复方甘草酸苷组:给予复方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1；③马齿苋总黄酮组:给予马齿苋总黄酮溶液35.6 g·kg-1；④正常对照组:给予等体积纯净水。于实验第1天开始灌胃给予药物或纯净水,连续30 d。

1.4.2 大鼠肝纤维化模型的建立 实验第1天开始,除正常对照组外,其余各组大鼠按2 mL·kg-1·d-1剂量腹腔注射四氯化碳溶液,正常对照组大鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,连续30 d。实验第31天,用20%水合氯醛溶液麻醉处死动物,使用大号钝剪刀迅速剖取大鼠肝脏,将其置于冰盘上,于冰冷0.9%氯化钠溶液中洗净血迹后,装于焦碳酸二乙酯溶液处理过的EP管中,放置液氮中快速冷冻,然后转移至-80℃超低温冰箱冻存,待做RT-PCR；取另部分肝脏放入高压灭菌的空白EP管内,置-80℃冰箱冻存,待做Western-Blot。

1.4.3 肝脏组织TGF-β1基因表达检测 Trizol法提取大鼠肝脏总RNA,分光光度法测定其在波长为260与280 nm处的吸光度(A值),用A260/A280估计RNA纯度,约2.0,提示为RNA纯品。按试剂盒说明进行逆转录和RT-PCR扩增。RT-PCR数据收集由7000 System SDS Software软件完成,通过软件计算所有样品的Ct值,以β-actin作为内参照基因进行校准,采用2-△△Ct方法对TGF-β1基因表达进行相对定量:△Ct=Ct (target)-Ct(ref)；Avg.△Ct(calibrator)=Avg.Ct (target,calibrator)-Avg.Ct(ref,calibrator)；△△Ct=△Ct-Avg.△Ct(calibrator)；2-△△Ct表示通过参照基因校准的TGF-β1基因的相对表达水平。TGF-β1和βactin引物信息见表1。

表1 TGF-β1和β-action引物Tab.1 Primer of TGF-β1and β-action

1.4.4 肝脏组织TGF-β1蛋白表达检测 细胞裂解法提取大鼠肝脏总蛋白,Lowry法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,Western-Blot蛋白质印迹。应用Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像系统成像,使用ScionImage软件对蛋白电泳带进行灰度值分析,以βactin作为内参照蛋白进行校准,采用TGF-β1蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值来表示TGF-β1的相对蛋白表达水平。

1.4.5 统计学方法 使用SPSS 17.0版软件进行统计分析。数据以均数±标准差(±s)表示,组间采用单因素方差分析,方差齐者组间进行LSD检验,方差不齐者进行Tamhane’s T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝脏细胞TGF-β1mRNA表达检测结果

2.1.1 RT-PCR熔解曲线分析 各组大鼠TGF-β1和β-actin熔解曲线中均有单一的主峰,TGF-β1的熔解温度(Tm值)均为86.12℃,β-actin的Tm值均为85.24℃,相同扩增条件下重复多次,得到的TGF-β1和β-actin熔解温度上下浮动不超过1℃,熔解曲线单一峰无非特异性荧光,说明产物特异性强,无引物二聚体,定量准确,见图1,2。

图1 TGF-β1荧光定量PCR熔解曲线Fig.1 RT-PCR melt curve of TGF-β1

图2 β-action荧光定量PCR熔解曲线Fig.2 RT-PCR melt curve of β-action

2.1.2 TGF-β1基因的2-△△CT值 正常对照组、模型对照组、复方甘草酸苷组、马齿苋总黄酮组大鼠肝细胞中TGF-β1基因的2-△△CT值分别为0.725±0.130,7.493± 1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝脏细胞中TGF-β1基因的2-△△CT值显著增大(P＜0.01),提示TGF-β1基因在纤维化肝细胞中呈过表达；与模型对照组比较,马齿苋总黄酮组大鼠肝脏细胞中TGF-β1基因的2-△△CT值显著减小(P＜0.01),提示马齿苋总黄酮可显著抑制大鼠纤维化肝细胞异常表达TGF-β1基因。TGF-β1基因和β-actin扩增曲线分别见图3,4。

2.2 大鼠肝脏细胞TGF-β1蛋白表达检测结果 见图5。与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝脏细胞中TGF-β1蛋白表达显著增大(P＜0.01),与RT-PCR结果一致；与模型对照组比较,马齿苋总黄酮组大鼠肝脏细胞中TGF-β1蛋白表达显著减小(P＜0.01)。各组大鼠肝脏TGF-β1蛋白Western-Blot见图6～9。

图3 TGF-β1荧光定量扩增曲线Fig.3 Fluorescence quantitative expansion curve of TGF-β1

图4 β-actin荧光定量扩增曲线Fig.4 Fluorescence quantitative expansion curve of βactin

3 讨论

肝纤维化常见的原因是由于乙醇、缺血、寄生虫、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、自体免疫攻击、非酒精性脂肪肝疾病、药物治疗,以及肝毒素等因素诱发肝细胞损伤,导致肝Kupffer细胞、肝窦状内皮细胞、肝成纤维细胞等其他类型肝细胞以及迁移的炎性细胞活化并释放大量的细胞因子和可溶因子,与此同时这些因子导致HSC或肝MFB细胞活化、分化与增殖,合成大量ECM,并逐渐沉积从而引起肝纤维化[6-7]。肝细胞、炎性细胞以及细胞因子之间相互影响并且形成一个复杂的网络结构。随着肝细胞的慢性损伤和纤维化,肝脏的结构和新陈代谢受到严重破坏,最终会导致肝硬化甚至肝癌,对人类的健康和生命具有极大的威胁。因此,对肝纤维化疾病发生发展过程中的最重要的细胞因子TGF-β1的动态变化及作用进行追踪,对于研究肝纤维化疾病的发生机制及治疗具有重要意义。

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05图5 4组大鼠肝脏TGF-β1蛋白相对表达量Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05Fig.5 Relative expression of TGF-β1protein of livers in four groups of rats

图6 正常对照组大鼠肝脏TGF-β1蛋白Western-Blot图Fig.6 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from normal control group

图7 模型对照组大鼠肝脏TGF-β1蛋白Western-Blot图Fig.7 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from model control group

本研究显示,马齿苋总黄酮可显著下调大鼠肝细胞中TGF-β1基因及其蛋白表达,提示马齿苋总黄酮可能通过调节大鼠肝组织中TGF-β1蛋白的信号传导通路,避免其过度激活,进而抑制了TGF-β1/Smad7信号通路其他关键成员的活化,最终减少了炎性因子的释放,减轻了肝细胞炎症,起到一定的抗肝纤维化作用。

图8 复方甘草酸苷组大鼠肝脏TGF-β1蛋白Western-Blot图Fig.8 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from glycyrrhizin aqueous group

图9 马齿苋总黄酮组大鼠肝脏TGF-β1蛋白Western-Blot图Fig.9 Western-Blot analyisis on TGF-β1protein of livers in rats from total flavonoids group

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.006

Effects of Total Flavonoids from Portulaca on Transforming Growth Factor β1in Rats with Hepatic Fibrosis

PAN Xiao-li,XIONG Yong-ai,TAN Yu-zhu,XIANG Hui
(School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effects of total flavonoids from portulaca against liver fibrosis in rats by detecting TGF-β1gene and protein expressions.MethodsA total of 48 SD rats were randomly divided into normal control,model control,glucyrrhizin aqueous,and total flavonoids groups,with 12 rats in each group.Except those in the normal control group, rats in other groups were intraperitoneally injected with 2 mL·kg-1·d-1carbon tetrachloride to induce liver fibrosis.Rats in glucyrrhizin aqueous group and total flavonoids ones were intragastrically administered with 15.75 mg·kg-1of glucyrrhizin aqueous solution or 35.6 mg·kg-1of total flavonoids aqueous solution,respectively.The normal and model control groups were administered with equal volume of aqueous solution.Thirty days later,rats were sacrificed by anesthesia.Livers were obtained to detect TGF-β1gene and protein expressions by RT-PCR and Western-Blot.ResultsRelative gene expression of TGF-β1in the normal control,model control,glucyrrhizin aqueous and flavonoids groups was 0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,and 2.668±1.150,respectively.Total flavonoids from portulaca significantly reduced the gene(P＜0.01)and protein(P＜0.01) expressions of TGF-β1.ConclusionEfficacy of total flavonoids from portulaca in treating hepatic fibrosis may be related to decreased TGF-β1expression in rats.

Total flavonoids from portulaca;Liver cirrhosis;Transforming growth factors

R285.5；R575.2

A

1004-0781(2014)09-1140-04

2013-04-24

2013-09-16

潘晓丽(1980-),女,重庆人,讲师,硕士,主要从事中药药效物质基础与质量标准化研究。电话:(0) 13880768673,E-mail:panpan_1388@sohu.com。