葛启隆,岳秀萍,王国英 (太原理工大学环境科学与工程学院,山西 太原 030024)

一株苯酚降解菌的分离鉴定及响应面法优化其固定化

葛启隆,岳秀萍*,王国英 (太原理工大学环境科学与工程学院,山西 太原 030024)

从太原市焦化厂废水活性污泥中分离、筛选出一株苯酚降解细菌,经生理生化反应和16S rRNA鉴定,该菌株为Diaphorobacter属细菌,命名为 PD-07.代谢机制研究表明,苯酚可诱导该菌合成邻苯二酚 2,3-加氧酶降解苯酚.为了提高该菌株对苯酚的降解率,以海藻酸钙为材料,对该菌株进行包埋固定化研究.首先采用Plackett-Burman实验设计筛选出影响固定化菌株苯酚降解率的关键因素,然后采用最陡爬坡实验逼近最大苯酚降解率响应区域.最后用Box-Behnken实验设计及响应面回归分析,应用二次方程对实验数据进行拟合得,拟合曲线与实验实测值相关性良好,最佳条件为海藻酸钠浓度3.83%(m/V)、CaCl20.3mol/L、菌胶比1:26.73、固定化时间2h、摇床转速180r/min、培养温度30℃、初始pH值7.2、液固比4.86:1,在此条件下苯酚降解率可达96.89%.

Diaphorobacter sp.PD-07；Plackett-Burman；海藻酸钠；固定化细胞；苯酚；生物降解；响应面法

℃

苯酚是煤气、造纸等工厂排出废水中主要污染物之一[1],水体中5～25mg/L的浓度即可对鱼类的生存构成威胁[2],因此,含酚废水的治理具有重要意义.目前,降解苯酚的方法主要包括吸附法,电化学法以及生物降解法等[3-5],其中生物降解法因低成本,无污染而被广泛采纳[6].

研究表明,具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌(Pseudonomonas.sp)[7]、芽孢杆菌(Bacillus.sp)[8]、酵母菌(Yeast trichosporon)[9]、根瘤菌(Rhizobia)[10]、醋酸钙不动杆菌(A. calcoaceticus)[11]等,其中,大部分研究主要集中在酵母菌、芽孢杆菌以及假单胞杆菌上,对 Diaphorobacter属的细菌研究鲜见报道.由于高浓度含酚废水对活性污泥中微生物生长有一定抑制作用[12],而固定化细胞技术因具有可固定优势菌种,提高污染物降解效率,抗毒性强以及延长细胞寿命等优点,在降解含酚废水方面表现出很大潜力.与传统活性污泥法相比,固定化细胞具有生物密度大,剩余污泥量小,反应过程易于控制等优点[13].

固定化微生物方法多种多样,其中以海藻酸钙为载体的包埋法最为普遍[14],该法固定的微生物存活力高,传质性能好,在反应工程中应用灵活

[15],但其可变影响因素较多[16],因此有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素,由于单因素实验不能确定主要因素、次要因素,而Plackett-Burman实验是基于不完全平衡块原理的实验设计,能够从诸多因素中快速有效地筛选出最重要的因素[17].响应面法是一种优化过程的统计学实验设计方法,其中Box-Behnken实验设计法比较常用[18].该法对各影响因子及其交互作用进行评价,建立曲面模型,确定最佳水平,与正交设计相比,该法所需实验组数相对较少,更能直观体现因变量最佳值[19].

本研究从焦化废水活性污泥中分离、筛选得到一株苯酚降解菌,并对该菌株进行鉴定及苯酚代谢途径分析.依据影响固定化细胞制备条件(海藻酸钠浓度、氯化钙浓度等)和培养条件(pH值、温度、液固比等)等因素依次进行 Plackett-Burman实验,最陡爬坡实验和 Box-Behnken实验,对影响固定化细胞苯酚降解率的相关因素进行了筛选和优化.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源 所用筛选菌株的活性污泥采集自太原市某焦化厂废水生物处理系统.

1.1.2 培养基 LB培养基(g/L)[20]:胰蛋白 10,酵母浸出粉 5, NaCl 10, pH 7.2～7.4.

自制选择培养基(g/L):K2HPO40.5, KH2PO40.5, CaCl20.1,NH4Cl 0.5, MgSO4·7H2O 0.2, MnSO4·H2O 0.01, Fe2(SO4)3·H2O 0.01, NaNO31.0, NaMoO4·2H2O 0.01,苯酚按需要量加入,pH 7.2～7.4.

以上培养基121℃高压灭菌20min,固体平板和斜面培养基均在上述培养基中加入 2%的琼脂粉.

1.2 实验方法

1.2.1 活性污泥的驯化 在液体培养基中利用苯酚作为唯一碳源进行梯度驯化,同时,在驯化的过程中观察微生物生长情况,60d后,活性污泥体系基本达到稳定.

1.2.2 菌株的分离纯化 取驯化后的培养液1mL,将其倍比稀释至 10-8,将稀释度为 10-2～10-8的菌液涂布于 LB平板培养基上,在生物培养箱中倒置培养 72h.根据菌落形态(形状,大小,隆起程度,透明程度,边缘形状和菌落颜色的差别)挑取高度分散的单菌落至营养琼脂斜面上进一步划线分离,通过镜检确定其为纯菌后,保存在 4℃的冰箱中备用.

1.2.3 苯酚降解菌株的筛选 将所有纯化的菌株分别接种至装有 LB培养液的三角瓶中,在摇床中连续活化 2代,并将次级培养物活化至吸光度为1.20左右(以LB培养基做空白,此时微生物处于对数生长期),接种到选择培养基中,摇瓶振荡培养,每隔一定时间检测培养物中苯酚浓度,从中选出苯酚降解率最高的菌株.

1.2.4 菌株的鉴定 参照文献[21]做该细菌的生理生化鉴定,16S rRNA测序由深圳华大基因研究院完成.

1.2.5 细胞粗酶液的提取 将筛选出的菌株接种到唯一碳源培养液(含100mg/L苯酚)和LB培养基中,30℃,180r/min摇床培养,取对数生长期后期菌液 10mL, 4℃,12000r/min高速离心5min,收集菌体,上清液留取待用,菌体用 pH=7磷酸盐缓冲液清洗两次,然后用磷酸盐缓冲液重悬细胞,置于冰水混合物中,用JY92-IIN型超声破碎仪破碎细胞,再次离心 20min,收集上清液即为粗酶液[22].

1.2.6 细菌DNA的提取 细菌DNA提取参见文献[23].

1.2.7 PCR反应 以基因组DNA为模板扩增,邻苯二酚-2,3加氧酶(C23O)引物为(5′-CCAGC AAACACCTCGTTGCGGTTGCC-3′)和(5′-AG AGGCATGGGGGCGCACCGGTTCGATCA-3′),邻苯二酚-1,2加氧酶(C12O)引物为(5′-CGCCT TCAAAGTTGATCTGCGTGGT-3′)和(5-GCCA ACGTCGACGTCTGGCA-3′)[24],PCR 反应体系:10×Taq聚合酶缓冲液5μL,MgCl2(25mmol/L) 3.75μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,引物各 1.25(10μmol/L)μL,模板 DNA 1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,加重蒸水至50μL.C23O的PCR程序如下:94℃变性 60s,57℃退火 45s,72℃延伸 60s,30个循环, 72℃最终延伸5min;C12O的PCR程序如下:94℃变性 60s,50℃退火 30s,72℃延伸 45s,30个循环,72℃最终延伸5min.测序结果用BLAST软件与 Genbank数据库中已收录的基因序列进行同源性比较.

1.2.8 固定化细胞的制备 将培养至对数生长期后期的种子培养液吸入离心管中,4000r/min离心10min,弃去上清液,生理盐水清洗3次.所得菌体制成4mL菌液与海藻酸钠混合,将混合物通过针筒滴入 CaCl2溶液中,交联沉淀,制成固定化细胞颗粒,搅拌一段时间后,4℃中静置硬化 24h,再用生理盐水洗涤备用[25].以上操作均在无菌条件下进行.

1.2.9 优化实验设计 本研究以苯酚降解率为响应目标,采用三步法进行优化,首先用Plackett- Burman实验设计选出对固定化细胞苯酚降解率影响较大的因素,然后用最陡爬坡实验确定响应面分析的中心点,最后利用响应面法中 Box- Behnken实验设计对影响固定化细胞苯酚降解率的因素进一步研究,通过实验数据拟合响应面模型,最终确定最佳条件,并进行验证,实验数据分析借助 Minitab和 Design Expert软件.

1.3 测定与分析方法

细胞浓度的测定采用可见分光光度法,在600nm波长下测定培养液的吸光度(OD600).细胞干重采用干燥恒重法测量,根据细胞干重标准曲线将吸光度转换为细胞干重;取培养液吸入离心管内,控制转速离心后将上清液弃去,离心管倒置数分钟,随即称量,湿菌体重量=离心后重量-离心管重量[25];苯酚浓度的测定:4-氨基安替比林直接光度法[27];邻苯二酚-1,2-加氧酶(C12O)活力测定:以单位时间内反应产物(粘糠酸)在 260nm处吸光度变化表示,邻苯二酚-2,3加氧酶(C23O)活力测定:以单位时间内反应产物(2-羟基粘糖酸半醛)在 375nm 处吸光度变化表示[28],测定系统总体系9mL,内含0.3mmol/L反应底物8.01mL,磷酸缓冲液(pH=7.0)0.39mL和0.6mL粗酶液,以磷酸缓冲液为参比.定义C12O(或C23O)活力单位(U)为25℃条件下每分钟反应产生1μmol粘糠酸(或 2-羟基粘糖酸半醛)所需酶量.总蛋白含量用Bradford法测定[29],酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算.

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离与鉴定

根据上述实验方法,从焦化废水活性污泥中分离纯化,筛选得到单菌落,应用涂布划线等纯化手段,得到24株苯酚降解细菌,再根据苯酚降解实验复筛得到一株苯酚降解能力最高的菌株,其编号为 PD-07,该菌 72h对初始浓度1400mg/L苯酚降解率为80.36%,其形态及生理生化实验研究,结果如下:菌落为圆形、表面光滑、不透明、端生鞭毛、短杆状、无芽孢、无荚膜;革兰氏染色阴性、氧化酶阳性、吲哚实验阴性、V-P实验阴性、明胶液化阴性、淀粉水解阴性、甲基红阴性、硝酸盐还原阳性、葡萄糖产酸阴性.

经16S rRNA测序获得的序列与 GenBank数据库中已收录的16S rRNA序列进行同源性比较分析得,该菌株16S rRNA序列(Genbank 中的登 录 号 为 :KF022039)与 Diaphorobacter nitroreducens具有 99%的同源性,结合该菌株的形态和生理学特性,初步判断该菌株为Diaphorobacter属细菌,命名为 Diaphorobacter sp.PD-07.

2.2 苯酚代谢途径及酶特性分析

分别采用引物 C12O、C23O 对菌株Diaphorobacter sp.PD-07的DNA进行PCR扩增,结果发现引物C23O有明显的扩增产物,而 C12O几乎没有得到扩增产物.对扩增的C23O基因测序后采用Blast程序对该序列进行比对,发现该片段与GeneBank中已登录的AB266139.1邻苯二酚2,3-双加氧酶的序列相比有 98%的同源性,表明菌株PD-07基因组中还具有邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.

1)根据果园环境特点，设计了果园红外测温系统测量果树的树冠、果实、枝叶以及果园环境等温度，减少了测量仪对测量目标的温度干扰，降低了成本，利于农业自动化和精细农业等相关技术的推广及应用。

在有氧条件下苯酚被苯酚羟化酶转化为邻苯二酚,邻苯二酚进一步被邻苯二酚 1,2-双加氧酶或邻苯二酚 2,3-加氧酶催化进行邻位或间位开环[30].通过测定菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶液中邻苯二酚 1,2-加氧酶和邻苯二酚 2,3-加氧酶的活性,初步判断该菌株降解苯酚的代谢途径.菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶活性检测如表 1所示,在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养液中,菌体粗酶液中邻苯二酚 2,3-加氧酶的比活力为0.298U/mg蛋白质,而邻苯二酚1,2-加氧酶的比活力仅为0.009U/mg蛋白质,因此推断该菌株降解苯酚以间位开环降解为主.菌体破碎后上清液中邻苯二酚 2,3-双加氧酶的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性,这表明该酶为胞内酶.以LB培养基(不含苯酚)为基质的两种上清液酶的活性均未检测到,说明该菌株邻苯二酚 2,3-加氧酶是诱导酶.

表1 不同基质中邻苯二酚加氧酶比活力(U/mg蛋白质)Table 1 Catechol dioxygenase specific activities in different substrates (U/mg protein)

2.3 Plackett-Burman实验确定影响固定化细胞苯酚降解率的主要因素

采用实验次数N=12的Plackett-Burman实验设计对影响固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的8个因素进行研究,每组实验重复3次,实验设计及结果见表2与表3,应用Minitab软件分析得模型的P=0.021,说明实验结果可信.苯酚降解率回归分析复相关系数为R2=98.35%,说明回归分析能够确切的描述实验数据.根据回归分析结果,可知海藻酸钠浓度、菌胶比(菌体湿重与胶液体积之比)以及液固比(培养液体积与固定化小球总体积之比)对苯酚降解率存在显著影响,其中,液固比P值最小(P=0.003),对固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率影响最显著,其次是海藻酸钠浓度(P=0.036),再次为菌胶比(P=0.048).其他 5个因素,CaCl2浓度,固定化时间,摇床转速,培养温度,初始pH值P值均大于 0.05,对固定化细胞苯酚降解率没有显著影响.由此,筛选出3个影响固定化细胞苯酚降解率的关键因素.

表2 Plackett-Burman 实验设计水平及数据分析结果Table 2 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 实验设计及结果Table 3 Design and result of Plackett-Burman experiment

2.4 最陡爬坡实验(Steepest ascent design)逼近最佳值区域

当逼近最佳值区域时才能建立有效的响应面拟合方程[31],故用最陡爬坡法快速逼近最大苯酚降解率区域.最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向,实验设计及结果见表4.

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Experimental design and the results of steepest ascent

2.5 响应面法(Response Surface Methodology)分析及最佳条件的确立

根据Box-Behnken实验设计原理,设计了三因素三水平的响应面分析实验,实验设计及结果见表5.应用Design Expert软件对实验结果进行二次多项回归拟合后,编码方程模型为:

式中:Y为苯酚降解率;A、B、C分别为海藻酸钠浓度、菌胶比、液固比的编码值.

图 1散点为实验所得苯酚降解率,表明实际值与模型预测值的偏离程度.其中散点为实验值结果,直线为预测值拟合直线.通过图1及回归模型方差分析和系数检验(表6)得到,模型复相关系数 R2=0.9969,表明固定化细胞苯酚降解率实验值与预测值之间有很好的拟合度.失拟项0.1214,差异不显著;校正决定系数 R2Adj=0.9928,表明仅有 0.72%的固定化细胞苯酚降解率变异不能由该模型进行解释.另外,统计学中Cook距离,即Di表明某一条数据记录被排除在外,由此造成的回归系数变化有多大,通常认为 Di<1时,该数据为合理数据[32].由图2分析也可知,用于诊断各种回归分析中是否存在异常数据的 Di值均分布在小于 1的理想范围内,不存在对回归系数的计算产生明显影响的数据,说明二次多项式很好地拟合了实验数据,因此该模型可用来对实验结果进行分析和预测.

表5 Box-Behnken实验设计及固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的实测值Table 5 Box-Behnken experimental design and measured values of phenol biodegradation rate of immobilized strain Diaphorobacter sp.PD-07in alginate

由表6中实验结果的F值可检验各因素的显著性,根据响应面分析三维图(图 3～图 5),可直观地看出各因素之间的交互作用,各因素对响应值的影响并不是简单的线性关系,且对响应值的影响存在一极值点.由表6回归系数显著性检验可得,海藻酸钠浓度、菌胶比及液固比这 3个因素对固定化细胞苯酚降解率的影响高度显著,其中海藻酸钠浓度、液固比和菌胶比、液固比之间对响应值的两两交互影响均非常显著,海藻酸钠浓度、菌胶比之间对响应值的交互影响不显著.在3D响应面图中表现为图4、图5的曲面较陡峭,Z轴的值域较大,而图3的曲面相对平缓,Z轴值域范围相对较小.

表6 Box-Behnken 实验回归分析结果Table 6 Results of regression analysis of the Box-Behnken design

图1 回归模型苯酚降解率预测值与实际值的关系Fig.1 Relationship between predicted value and actual value of regression model

将模型构建的方程进行偏导微分处理,得到最佳理论水平为:A =-0.34,B =-0.26,C =-0.28,即:海藻酸钠浓度3.83 %(m/v)、菌胶比1:26.73、液固比 4.86:1.此时,固定化细胞苯酚降解率的最大预测值为97.35 %.

图2 回归模型的Cook距离分布Fig.2 Distribution of Cook’s distance of regression model

图3 以苯酚降解率为响应值海藻酸钠浓度与菌胶比的响应曲面Fig.3 Response surface plotted on Sodium alginate concentration and bacteria-cement ratio

图4 以苯酚降解率为响应值海藻酸钠浓度与液固比的响应曲面Fig.4 Response surface plotted on Sodium alginate and liquid-solid ratio

图5 以苯酚降解率为响应值菌胶比与液固比的响应曲面Fig.5 Response surface plotted on bacteria-cement ratio and liquid-solid ratio

2.6 模型验证及分析

为了验证模型预测的准确性和有效性,在预测的最佳条件下进行 3组平行实验,所得苯酚平均降解率为96.89%,可见回归方程得到苯酚去除率的理论预测值与其实验值非常接近,误差仅为0.46%.固定化细胞与游离态细胞对比实验结果如图6所示,实验对照组中仅有2.3%的苯酚被去除,这说明苯酚蒸发及海藻酸钙凝胶小球(未包埋细菌)吸附作用对实验影响甚微,可忽略不计.固定化细胞苯酚降解时间比游离态细胞降解时间略短,这很可能是因为就该菌株而言,与高浓度苯酚对其抑制作用相比,海藻酸钙凝胶小球对底物的传质阻碍作用相对较小,这与 Wu 等[33]对固定化菌株 Yarrowia lipolytica W29降解废水中COD研究结果一致.

图6 固定化细胞与游离态细胞对苯酚的降解Fig.6 Phenol degradation by free and immobilized cells of strain Diaphorobacter sp. PD-07

3 结论

3.1 从活性污泥中分离得到一株苯酚降解菌,经生理生化反应及 16S rRNA 测序鉴定为Diaphorobacter属细菌.该菌株可利用苯酚作为唯一碳源和能源,72h对初始浓度1400mg/L苯酚降解率为 80.36%,命名为 Diaphorobacter sp. PD-07.

3.2 通过测定邻苯二酚双加氧酶的活性,初步认为在苯酚的生物降解过程中,由苯酚羟化酶催化转化为邻苯二酚,再由邻苯二酚 2,3-双加氧酶将其转化为2-羟基粘糖酸半醛,邻苯二酚2,3-双加氧酶是该菌株催化邻苯二酚开环的诱导型关键酶.

3.3 采用 Plackett-Burman实验设计筛选出影响海藻酸钠包埋固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的主要因素,即海藻酸钠浓度、菌胶比和液固比,其中液固比为影响最大的因素.

3.4 应用响应面优化设计法确定固定化苯酚降解菌株的最佳条件为:海藻酸钠 3.83%(m/v)、CaCl20.3mol/L、菌胶比1:26.73、固定化时间2h、摇床转速180r/min、培养温度30℃、初始pH值7.2、液固比 4.86:1.在此条件下苯酚降解率可达96.89%.

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GE Qi-long, YUE Xiu-ping*, WANG Guo-ying (College of Environmental Science and Engineering,

Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：518～525

A phenol-degrading strain was isolated from the activated sludge of a cokes wastewater treatment facility in Taiyuan City. Based on its physiology, biochemical characters and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, the isolated strain named PD-07 was identified as a member of the genus Diaphorobacter. Metabolic pathway research showed that the strain could be induced to synthesize intracellular catechol-2,3-dioxygenase.To improve the phenol degradation rate, a study of embedding immobilized strain was conducted with calcium alginate as material. Firstly, factors playing important roles in the phenol degradation rate of immobilized cell were selected based on Plackett-Burman design. Then the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the phenol degradation rate. Finally, the optimal levels of those main factors were further optimized by using Box-Behnken design and response surface analysis. Quadratic equation was adopted to fit the test data. The fitting curve had a good correlation with the measured values. The optimal conditions were as follows: alginate concentration 3.83%(m/V), calcium chloride concentration 0.3mol/L, bacteria-cement ratio 1:26.73, immobilized time 2h, rotation rate 180r/min, culture temperature 30 , initial pH value 7.2, liquid-solid ratio 4.86:1. Under the optimal conditions mentioned above, the phenol degradation rate reached 96.89%.

Diaphorobacter sp. PD-07；Plackett-Burman；sodium alginate；immobilized cell；phenol；biodegradation；response surface methodology

X172

：A

：1000-6923(2014)02-0518-08

葛启隆(1988-),男,山西运城人,太原理工大学环境科学与工程学院硕士研究生,主要从事环境微生物及水污染控制研究.

2013-06-10

国家自然科学基金资助项目(51378330);山西省青年科技研究基金(2013021023-3);山西省环境保护厅环保科研项目(201205)

* 责任作者, 教授, yuexiuping1990@126.com