底丽娜，南海辰，夏利宁

（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052）

在世界各地及我国香港，科学家从报道的超级细菌中提取出了携带编码对很多抗生素耐药的新德里金属β-内酰胺酶的基因［1-2］，β-内酰胺酶再度成为全球关注的焦点。英国已成立了有关治疗超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）阳性大肠埃希菌引起疾病的抗生素资料库［3］。TEM型β-内酰胺酶是目前世界上最为流行且种类最多的质粒编码的丝氨酸蛋白酶，很多国家和地区都有相关报道，给临床抗感染治疗带来极大的困难。本文就TEM型β-内酰胺酶的出现与流行、分子生物学特征、耐药机制和检测方法等研究进展进行综述。

1 TEM型β-内酰胺酶的出现与流行

TEM-1由希腊学者Datta等于1965年首次从大肠埃希菌中分离出，以患者的名字（Temoneira）命名。1969年英国报道TEM-1的第一个变异体TEM-2。1987年，法国Sirot D等在分离的肺炎克雷伯菌中发现了由质粒介导的对头孢噻肟耐药的新的β-内酰胺酶CTX-1（TEM-3）。1989年，法国研究员Vedel等首次在大肠埃希菌中分离到耐酶抑制剂的TEM 型β-内酰胺酶（inhibitor-resistant TEM，IRT）。1997年Francino M P［4］从大肠埃希菌中分离出了第1株同时具有ESBLs和IRTs表型的复合突变 TEM 酶（complex mutant of TEM，CMT）。TEM型ESBLs主要在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现，在产气肠杆菌、摩根菌、奇异变形杆菌、雷普罗威登斯菌、沙门菌属等其他肠杆菌中也有报道［5］。目前TEM型β-内酰胺酶的分布已由最初的欧美国家发展到世界各地，但各个国家、地区甚至医院所占优势的基因型各不相同。在欧洲主要流行的有TEM-3、TEM-4、TEM-52；美国、南美主要流行TEM-26、TEM-10；印度的一家医院出现过 TEM-92的流行［6］，中国所分布的TEM酶以TEM-1型最常 见。 近 几 年 来，TEM-12［7］、TEM-57［8-9］、TEM-141［10］及 TEM-166［11］等在中国也相继被发现并报道。

2 TEM型β-内酰胺酶的主要生物学特性

2.1 结构

TEM型β-内酰胺酶属于Ambler分类中的A类，Bush-Jacoby Medeiors功能分类中的2b群。TEM 酶呈酸性，等电点（pI）一般在5.2～6.5。各型TEM基因碱基总长度均约为900bp。

A类酶的氨基酸序列有较大的同源性，且在三级结构上非常相似。早在1995年，Knox利用X射线晶体衍射技术在原子水平展现了A类TEM型β-内酰胺酶的三维空间结构，它以丝氨酸为活性中心，具有一个α螺旋结构域和围绕该结构域的5条反向平行β折叠片层。这一组由α螺旋和β折叠所构成的功能结构域共同维持着TEM型酶空间结构的稳定性，并且共同构成一个催化腔。催化活性中心Ser70位于α螺旋H2的N端，其边缘为一氧负离子穴，β-内酰胺底物被紧紧拉向氧负离子穴并被极化，从而发生乙酰化和去乙酰化的水解反应［12］。

目前已得到了多种β-内酰胺酶的晶体结构包括蛋白与药物、蛋白与药物分子水解中间体的复合物等。随着科学技术水平的提高，已有学者应用电子核双共振光谱、核磁共振等方法、解析并获取酶的三维结构，展示临床常见的β-内酰胺类抗菌药物与β-内酰胺酶之间的具体相互作用机制［13］。因此，TEM型β-内酰胺酶亚型的三维空间结构逐渐被揭晓。2011年，Docquier J D等［14］报道了 TEM-72的晶体结构特性。

2.2分类和表型特征

TEM型β-内酰胺酶根据其水解底物谱，可分为4类，即广谱β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶、耐酶抑制剂TEM型β-内酰胺酶和复合突变TEM型β-内酰胺酶［6，12］。

2.2.1 广谱β-内胺酶 TEM型广谱β-内胺酶包括TEM-1和TEM-2，其他TEM型酶均由它们衍生而来。TEM-1是最早被发现的TEM型，也是最为常见的β-内酰胺酶，在耐氨苄西林的大肠埃希菌中，90%的菌株产生TEM-1。它能够水解青霉素类和第1代头孢菌素，对超广谱头孢菌素的水解能力很低，其活性可被克拉维酸所抑制。TEM-2型与TEM-1型相比，只是39位氨基酸残基发生了Ser突变为Lys，而二者生化特性几乎完全一致，等电点由5.4变为5.6，其底物谱无明显改变，但产TEM-2的菌株明显少于TEM-1菌株。TEM-13与TEM-2仅在265位上由蛋氨酸取代酪氨酸，该位点的改变不影响酶活性和酶的底物范围，所以TEM-13和TEM-1、TEM-2一样也是广谱酶。新发现的TEM-166编码基因序列与TEM-1相比，1个核苷酸的改变导致第120位的氨基酸发生变化，即Arg120→Gly。两者的耐药特性几乎完全相同，对哌拉西林高度耐药，但对第3代头孢菌素、亚胺培南均敏感［6］。

2.2.2 超广谱β-内酰胺酶 TEM-3是第1个TEM型ESBLs。TEM型ESBLs均由广谱酶TEM-1和TEM-2的编码基因发生突变造成1个～5个氨基酸改变而形成，如TEM-5、TEM-10来源于TEM-1而 TEM-16、TEM-22则来源于 TEM-2。TEM型ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，也发现于其他一些肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌。其表型特征为对第3代头孢菌素耐药，但对β-内酰胺酶抑制剂敏感。与母体酶TEM-1比较，由于TEM型ESBLs活性位点丝氨酸附近出现了1个～5个氨基酸残基的替换，改变了其与底物间的空间构效关系，从而表现为ESBLs的酶动力学特征。其主 要 突 变 位 点 在 Glu104Lys、Argl64Ser/His、Gly238ser和Glu240Lys。突变位点164位精氨酸→丝氨酸、组氨酸，此位点突变可导致底物结合腔扩大，使酶与β-内酰胺类抗生素充分发生作用；104位谷氨酸→赖氨酸、240位谷氨酸→赖氨酸，104和240位点氨基酸取代能加强酶对头孢他啶的水解；238位甘氨酸→丝氨酸，见于部分TEM型酶和大部分SHV型酶中，此位点突变可提高酶对头孢噻肟的水解能力［15］。

2.2.3 耐酶抑制剂 TEM 型β-内酰胺酶 由于酶抑制剂的大量使用，进而发生新的突变，产生耐酶抑制剂TEM型β-内酰胺酶IRTs。1991年首次从临床分离的大肠埃希菌中发现，其表型特征为对β-内酰胺酶/克拉维酸耐药，但对头孢菌素类敏感。IRTs的突变位点主要位于69、244和276位上，当TEM-1、TEM-2中69位的蛋氨酸被替代时，由于69位靠近酶的活性位点Ser70，Ser70会发生移位（即酰化反应点移位），会影响水解反应的进行［6］。

2.2.4 复合突变TEM型β-内酰胺酶 因TEM变异导致的一些复杂的TEM变异体CMTs，则兼有ESBL和IRT的突变位点，同时具有ESBLs和IRTs的特性，能同时水解第3代头孢菌素和β-内酰胺酶抑制剂，如TEM-50、TEM-68。关注一下近几年报道的复合突变TEM 型β-内酰胺酶的耐药特征，TEM-125的突变位点既包含ESBLs TEM-12的突变位点，又包含耐酶抑制剂TEM-39（IRT-10）的突变位点，耐药表型对头孢他定耐药同时，对克拉维酸也高水平耐药［16］。

3 TEM型β-内酰胺酶的耐药机制

氨曲南是首个应用于临床的属单环β-内酰胺类抗生素，该药物比青霉素类和头孢菌素类抗生素对β-内酰胺酶表现出了较高的稳定性。但近年来的研究发现，从临床发现抗氨曲南的菌株中分离得到TEM型β-内酰胺酶的一些突变体，如238位的甘氨酸突变为丝氨酸和240位的谷氨酸突变成赖氨酸或者精氨酸（G238S-E240K/R），这些突变都会对氨曲南的敏感性有所降低，从而出现耐药［17］。细菌对β-内酰胺类药物耐药最主要的耐药机制是产β-内酰胺酶。编码ESBLs的基因多位于质粒上，位于质粒DNA上的ESBLs编码基因常常可以在接合性质粒的tra操纵子、转座子以及整合子的作用通过转化、转导、结合方式，在同种属甚至不同种属细菌的质粒与质粒间、质粒与染色体间不断转移，发生产酶基因的垂直和水平传播。

β-内酰胺酶耐药基因突变可引起广泛耐药，按突变的位置不同可分为两类。一类是发生在结构基因上的突变，其突变的结果是导致新酶的产生。如TEM和SHV型超广谱β-内酰胺酶可通过结构基因上单点或多点突变衍生大量的新型超广谱酶。第2类突变是发生在结构基因以外的区域，多数为启动基因或调节基因（TEM-1、TEM-2来源的ESBLs的启动子活性较强），调节基因的改变会造成结构基因的过度表达，使产酶量增加而导致耐药［18］。2013年，孙景勇等［19］研究证实，在大肠埃希菌中 Pa/Pb启动子调控的TEM-1β-内酰胺酶的高表达可使细菌对哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮耐药，而且这种耐药基因位于转座子和质粒上，可通过接合转移扩散，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。

这些突变对酶主要有3方面的影响：①扩大催化腔的空间，使具有较大侧链取代基的第3代头孢菌素能够进入而被水解；②提高对第3代头孢菌素的亲和力；③抑制酶其他位点的突变，提高酶的稳定性，增加酶的产量［20］。

4 检测

时至今日，已有216种TEM型β-内酰胺酶（http：//www.lahey.org/Studies/temtable.asp）被发现，TEM型β-内酰胺酶在世界各地的持续传播，部分原因是由于缺少可靠、全面的检测方法。实验室检测中，人们曾使用等电点法、TEM特异的DNA探针、基因芯片法、变相高效液相色谱技术、PCR测序等方法进行鉴定，而由强启动子Pa/Pb突变引起TEM-1β-酰胺酶的高表达在临床实验室常规的ESBL筛选和确证试验中表现为阴性［21］，容易误导临床医师错误地使用第3代头孢菌素头孢哌酮，应该引起重视。

食源性耐药菌可通过多种途径将耐药基因传递给人类致病菌，不仅危害人类健康，还可引起禽产品中药物残留、食品安全问题［22］。鉴于TEM基因型耐药菌株仍然是目前耐药菌株的主要和常见亚型，近年来，我国也逐渐加强对动物源食品中TEM型β-内酰胺酶的检测。如陶虹等［23］采用双重PCR检测方法对出入境食品安全中TEM和CTX-M的基因检测，张立静［24］采用双抗夹心法建立了对牛奶中TEM-1型β-内酰胺酶的胶体金免疫层析方法，制备出快速检测试纸条，该试纸条灵敏度、特异性、稳定性均良好。快速检测是临床及时合理进行抗菌治疗的前提，建立一种可靠的检测方法能应用于实际生活和实验室，是当今科研人员面临的任务。

5 策略

随着β-内酰胺酶抑制剂的大量使用，TEM型超广谱β-内酰胺酶水解这些药物的能力也逐渐加强，主要是活性位点的替换，活性位点的替换导致酶的稳定性降低。无论何种突变其对耐药的贡献最终还需要通过β-内酰胺酶分子作为桥梁，目前关于β-内酰胺酶及突变型的研究大多数是从试验方面入手，这些试验结果可以使我们很好的了解近期某个地区内新型耐药菌株的产生和变化，以利于选择可以达到临床治愈效果的β-内酰胺类抗生素。随着科学技术的发展，已广泛用于研究蛋白-药物、蛋白-蛋白以及蛋白-DNA/RNA作用机制的分子动力学模拟在研究β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶等靶标之间的相互作用机制中发挥着越来越重要的作用［13］。因此，对β-内酰胺酶与底物之间构效关系的研究是酶介导的耐药机制研究中的另一个重要方面，并且逐渐成为国内外学者研究的热点。

Brown N G等［25］发现一种 M182T替代物，可作为TEM-1β-内酰胺酶的抑制基因，如能将其与药物有机地结合，便可提高药物的稳定性，减少细菌耐药。Drawz S M等［26］根据β-内酰胺酶活性和耐药机制，有望在未来30年里，研制出一种能恢复β-内酰胺类抗生素活性的“第2代”β-内酰胺酶抑制剂。我国班一禾课题组从蛋白酶与抗生素相互作用的角度出发，运用分子动力学模拟结合分子对接，结合自由能计算等方法选取TEM型β-内酰胺酶-氨曲南为研究对象，围绕酶突变后对药物分子氨曲南的敏感性降低展开，对酶突变后与氨曲南的结合模式改变情况进行分析并找到结合力改变的原因，从分子水平解释了靶标和药物之间的相互作用模式，对基于该靶标设计新型β-内酰胺类抗生素的研发工作起着重大作用。同时这些计算方面的方法和结果对今后进一步研究TEM型β-内酰胺酶家族以及其与β-内酰胺类抗生素尤其是第3代、第4代头孢菌素和单酰胺环类抗生素的相互作用机理提供了新的思路，也为解决临床新型抗生素的设计问题提供了参考［13］。

6 结语

总之，随着抗生素的使用日益增多，新的TEM型β-内酰胺酶在世界各地不断被发现，其衍变规律还有待于进一步揭示。目前，多数ESBLs三维空间结构与底物构效关系的阐述还停留在现有模型的推测上。我国需加强科研能力，从分子水平上对β-内酰胺酶与抗生素相互作用的机制、产酶基因的结构和功能进行更深入研究。通过加强此方面的深入研究，将为分子流行病学监测和预防、指导临床工作者合理使用抗生素以及新药设计、开发提供有力的理论依据。

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