陈弟诗，任玉鹏，张 斌，李 丽，聂艳如，周莉媛

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.四川动物疫病预防控制中心，四川成都610041）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以不同年龄段猪只的剧烈腹泻、呕吐和脱水等为特征的高度接触性传染病。哺乳仔猪发病率和病死率可达50%以上，是僵猪形成和育肥猪掉膘的主要原因之一［1］。PED在世界范围内流行极为广泛，如韩国、泰国、越南、日本等均有本病发生的报道［2-4］；Chen Q 等［5］对2013年美国部分暴发腹泻病养殖场的猪只小肠上皮细胞做病原分离鉴定，获得2株PEDV分离株，表明该病在美国被发现，并导致严重经济损失。刘孝珍等［6］对采自我国北京、上海、黑龙江、山东、河南、浙江、广东、广西、福建、新疆等10省（市、区）的猪腹泻样本进行了RT-PCR检测，PEDV在腹泻猪样本中普遍存在；2010年-2011年，中国南部10省猪场均暴发该病，导致猪死亡总数超过100万头［7］。由此可见，PEDV已经成为制约养猪业发展的重要病因之一。

PEDV纤突蛋白基因（S protein gene）是免疫优势基因，推导的氨基酸序列疏水性区域密集，具有多个糖基化位点和抗原指数较高区域，在以其为候选基因的疫苗与诊断技术研究中表现出良好特异的免疫原性［8］。遗传进化分析结果显示，S基因N′端存在较高变异性，不同分离株S基因序列中核苷酸插入、突变和删减常导致氨基酸序列变化，对肽链疏水性和糖基化位点产生影响，进而改变病毒原始抗原特性。此外，S蛋白在病毒与宿主细胞膜融合入侵和诱导中和抗体产生的过程中发挥重要作用［9］。本文就目前PEDV S基因及编码蛋白功能相关研究进展做一综述。

1 PEDV的基因组结构

PEDV 1995年被第五届国际病毒命名委员会正式列为冠状病毒科成员，具有冠状病毒典型形态特征。通过电镜观察发现粪便中的病毒粒子具花瓣状纤突，长约14nm～20nm，病毒粒子平均直径约95nm ～190nm［10］。PEDV 基 因 组 全 长 为27 000bp～30 000bp，除末端非编码区序列和3′端poly（A）序列外，主要包括6个开放阅读框（open reading frame，ORF），其中 ORF1ab参与病毒RNA合成；PEDV具感染性的基因组RNA释放入细胞质后，病毒ORF1ab翻译成多聚前体蛋白，经木瓜样蛋白酶（PLP）和主要蛋白酶（Mpro）剪切和转译处理后，参与基因组复制。E基因编码小膜蛋白，主要参与病毒的组装和出芽过程［11］；ORF3基因编码一种离子通道蛋白与病毒致病性相关，研究发现当ORF3基因被siRNA沉默时，PEDV对细胞感染性相应降低［12］；M基因包含681个核苷酸，可编码226个氨基酸多肽的囊膜蛋白，能介导机体产生IFN-α；N基因全长1 700bp，编码病毒核衣壳蛋白；S基因编码病毒纤突蛋白，在病毒对宿主吸附和入侵过程中起重要作用；该基因是病毒主要免疫原性基因，在诱导机体中和抗体产生过程中发挥重要作用；此外，遗传进化分析显示不同毒株S基因核苷酸序列均存在差异，N末端序列存在高度变异性，可能导致病毒抗原性改变［13］。

2 PEDV S基因及其编码蛋白的功能

2.1 PEDV S基因

PEDV S基因位于基因组ORF1ab和ORF3之间，全长4 152bp，编码1 383个氨基酸组成的分子质量约180ku～220ku的多肽。其起始密码子AUG后有一段与S蛋白膜易位相关的疏水性多肽链。在基因上游8个碱基处有一段“GUAAAC”序列，在亚基因mRNA（sgmRNA）转录起始过程中发挥重要作用［14］；S基因变异 性较大，Lee D K 等［15］对7株韩国PEDV毒株的S基因进行序列分析发现，相比参考株序列存在15bp碱基插入和9bp缺失，且变异均发生在N末端区域；此外，用不同毒株S基因N端序列做系统进化分析与全基因序列结果具一致性，这提示S基因N端1 100bp多样性可用于流行毒株的分子流行病学调查和疫苗候选株筛选。Chen J等［16］对除西藏和青海外的中国29省（市、区）577份腹泻样品进行分子流行病学调查分析，证实33个分离株都不同程度在S基因N末端1 aa～370aa存在基因的删减或插入，导致各毒株糖基化位点数量和抗原性存在差异；通过遗传进化分析将PEDV毒株分为2个大群G1、G2，而G1大群又分为3个亚群G1-1、G1-2、G1-3；其中13个近期流行株与CH/S、LZC、LJB/03、JS-2004-2和 DX株等5个经典中国株归于G1-1群，与CV777减毒株推导氨基酸序列同源性在96.0%～99.9%；其余20个分离株则归于G2大群，与CV777减毒株同源性为93.6%～95.4%；由此可见当前国内外部分PEDV流行株存在遗传变异。

2.2 S基因编码蛋白

由PEDV S基因推导的氨基酸序列包含信号肽区（1aa～24aa）、胞外区、跨膜区（1 334aa～1 356aa）和胞内区，存在29个潜在的糖基化位点；疏水性分析表明，S蛋白除C端第1 326aa～1 364aa位氨基酸疏水性较高外，其余区域也都存在不连续疏水位点［17］，这与S蛋白在病毒致病机制中扮演的角色相符。S蛋白外部结构域有介导机体产生中和抗体的抗原表位和与宿主细胞表面大分子结合的受体结合域，羧基末端细胞质结构域主要由疏水氨基酸组成，对S蛋白起固定作用［12］。尽管不像其他冠状病毒如MHV、BCV和IBV的S蛋白氨基酸序列存在天然蛋白水解位点将其分为两个区，但对PEDV S基因分析表明，在752位～755位、781位～789位氨基酸处也分别具有GxCx基序和保守九肽序列［18］，故可人为地将PEDV S蛋白分为S1（1aa～735aa）区和S2（736aa～1 383aa）区。

S1区包含多个病毒主要中和表位和受体结合域，与病毒抗原性和吸附入侵密切相关［19］。如在不同PEDV毒株S1基因中均发现一段核心表位COE基因 （1 495bp～1 923bp）［20］，经乳酸杆菌表达或从烟草中获取的重组COE蛋白均与PEDV天然抗原具相同反应原性［21］；孙东波［15］用兔抗 PEDV 多克隆抗体对PEDV S1基因特异性肽库进行生物淘汰，鉴定出3个B细胞抗原表位（248aa～280aa、442aa～499aa、499aa～638aa），并证实经E.coli BL21（DE3）系统表达的3种融合蛋白，均能刺激小鼠机体产生中和抗体；为以S基因免疫原性区域作候选基因研发PEDV诊断试剂盒及新型疫苗奠定基础。近年对PEDV宿主细胞受体的研究表明，PEDV可感染表达猪氨基肽酶N（pAPN）不同基因片段的MDCK细胞，间接证明pAPN为PEDV的细胞受体［22］；进一步研究发现S蛋白249aa～529aa存在一个潜在pAPN受体结合区MRR，且经Bac-to-Bac杆状病毒表达的MRR重组蛋白可与PEDV多克隆抗体产生反应，这为阐明病毒pAPN受体结合位点，揭示吸附入侵机制提供可能［15］。

S2区作为S蛋白穿膜部分，序列相对稳定，在病毒与宿主细胞膜融合的信号转导过程中发挥重要作用，其融合活性也决定着病毒的组织嗜性和对细胞的侵染能力［23］。对冠状病毒科成员SARS病毒研究发现，其S蛋白S2区内存在一段七肽重复序列（HR），生物信息学分析表明2个HR结构域（HRl与HR2）序列具高度保守性，它们相互作用形成的六螺旋束在病毒入侵细胞时导致病毒包膜和细胞膜发生重排，促使病毒膜融合的发生。此外，研究发现S2蛋白的一个半胱氨酸区域两旁的保守残基C822和C833是重要的活化膜融合位点［24］。这为PEDV S2区膜融合相关结构域的探索和病毒膜融合机制研究提供了参考。

3 基于S基因的新型疫苗

20世纪90年代中国农业科学院哈尔滨兽医研究所开发的TGEV-PEDV二联灭活苗和弱毒苗沿用至今，对国内PED防控具有重要作用。但近年来PED发病率逐年上升，对PEDV分子流行病学调查显示，部分PEDV野毒株毒力及免疫原性相关基因，ORF3基因［25］、S基因等［7］均出现碱基删减、插入或突变，推测这是传统商品化疫苗保护效力降低的可能原因，所以新型疫苗的开发具有重要意义。而PEDV S基因作为病毒主要免疫原性基因，已鉴定出具多个保守性中和抗原表位，因此是目前基因工程疫苗研制的主要候选基因之一。如Suo S等［26］以pVAX1为真核表达载体，分别构建了表达S基因、S基因N末端序列和IL-18的重组质粒，动物试验表明，pVAX1-S1和pVAX1-IL18载体联合免疫小鼠组血清特异性抗体水平显著高于其他组，且小鼠血清具有病毒中和作用，这为以S基因开发核酸疫苗提供了新思路；Ge J W 等［27］用共表达COE基因与大肠埃希菌不耐热肠毒素基因的重组乳酸菌免疫小鼠后77d，在小鼠粪便、阴道、鼻黏膜、小肠黏膜及血清中的抗PEDV IgA抗体均显著升高，IgG抗体水平也明显高于对照组。Bae J L等［28］将表达PEDV S基因部分中和抗原表位的重组载体转化至烟草中构建了转基因烟草植物，用其饲喂小鼠后，体液免疫水平明显上升，采集血清进行空斑减少试验，发现可明显抑制PEDV感染。上述研究结果表明，以S基因为靶基因构建的重组质粒、活载体疫苗或转基因植物，均能刺激试验动物机体产生良好的体液和细胞免疫反应，且试验动物血清具有病毒中和作用，这为PED新型疫苗的开发提供了重要的理论和数据支持。

4 基于S基因的诊断技术

目前，已知的导致猪腹泻因素较多，诸如细菌、病毒、寄生虫及营养性因素均可引起仔猪腹泻症状，单纯以临床症状和病理剖解变化为依据判定病因非常困难，故建立PEDV快速诊断方法具有重要意义。在实验室检测技术中以分子生物学和免疫学技术为主流，主要针对病毒保守和具良好免疫原性的基因进行研究。而PEDV基因组中，以M、N基因保守性相对较高，目前在建立RT-PCR检测法、荧光定量RT-PCR法、RT-LAMP法等主要用上述二基因作为靶基因［29-30］；S基因保守区域也可以作为检测靶点；Kim S Y等［31］分别对TGEV和PEDV S基因设计特异性引物，建立了鉴别诊断这两种病原的双重RT-PCR法，在90份临床样本的检测中表现出较高敏感性，且对轮状病毒、牛腹泻病毒及其他引起猪腹泻的细菌性病原均不检出，表明该法具有临床应用价值；此外，由于S蛋白是病毒与宿主细胞吸附和受体识别的主要蛋白之一，具良好免疫原性和反应原性，因此在免疫学诊断技术的建立中应用较广。如Knuchel M等［32］用S蛋白和N蛋白分别建立的ELISA方法进行比较探索，发现S-ELISA比N-ELISA法在免疫测定中更为有效；Cao L等［33］构建了表达PEDV S1基因N末端序列的E.coli BL21（DE3）重组菌，通过杂交瘤细胞技术获得一株表达S1蛋白单克隆抗体的Vero E6细胞，通过间接ELISA、Western blot及间接免疫荧光技术验证了抗体的反应原性，为PEDV特异性免疫学诊断方法的建立奠定了基础。

5 结语

当前对PEDV S基因研究主要集中于基因结构分析及功能预测，遗传进化分析和蛋白免疫原性分析等方面。大量试验数据证实不同PEDV流行株S蛋白N端序列存在不同程度的变异，可能是导致病毒抗原性改变的原因，故有必要进一步对各地方流行株PEDV遗传背景进行调查，为病原诊断和现地疫苗候选株筛选提供依据。已预测和鉴定的S基因多个保守性中和抗原表位，经重组菌或重组病毒等多种形式获得表达，在用小鼠作为动物模型的试验中表现出良好的免疫原性，但也存在诸多问题，如重组菌或重组蛋白诱导体液和细胞免疫水平上升不够显著，与传统疫苗相比保护效力不足，新型疫苗或诊断方法缺乏广泛临床验证等。此外，虽已证实pAPN为PEDV细胞受体，但关于S基因受体结合域具体位点尚未探明，S蛋白与pAPN受体结合后如何进行一系列信号转导促使细胞膜重排和融合等机制还需进一步研究来揭示。

［1］Moeser A J，Blikslager A T.Mechanisms of porcine diarrheal disease［J］.J Am Vet Med Assoc，2007，231（1）：56-60.

［2］Park S J，Kim H K，Song D S，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）field isolates in Korea［J］.Arch Virol，2011，156（4）：577-585.

［3］Puranaveja S，Poolperm P，Lertwatcharasarakul P，et al.Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus，Thailand［J］.Emerg Infect Dis，2009，5（7）：1112-1115.

［4］Duy D，Toan N T，Puranaveja S，et al.Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）isolates from southern vietnam during 2009-2010outbreaks［J］.Thai J Vet Med，2011，41（1）：55-64.

［5］Chen Q，Li G，Stasko J，et al.Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak in US swine［J］.J Clin Microbiol，2014，52（1）：234-243.

［6］刘孝珍，陈建飞，时洪艳，等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析［J］.中国预防兽医学报，2012，34（3）：180-183.

［7］Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，china［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（1）：161-163.

［8］王晨枫，左玉柱，裴丽华，等.猪流行性腹泻病毒HB/FN株S基因的克隆、原核表达及免疫原性分析［J］.动物医学进展，2013，34（5）：21-25.

［9］Yeo S G，Hernandez M，Krell P J，et al.Cloning and se-quence analysis of the spike gene ofporcine epidemic diarrhea virus Chinju99［J］.Virus Genes，2003，26（3）：239-246.

［10］Sergeev O V.Porcine epidemic diarrhea［J］.Vopr Virusol，2009，54（2）：4-8.

［11］张百灵，陈建飞，邢雅玲，等.猪流行性腹泻病毒（PEDV）与抗病毒天然免疫［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011，27（6）：516-523.

［12］Wang K，Lu W，Chen J，et al.PEDV ORF3encodes an ion channel protein and regulates virus production［J］.FEBS Lett，2012，586（4）：384-391.

［13］Tian Y，Yu Z，Cheng K，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of new variants of the porcine epidemic diarrhea virus in Gansu，China in 2012［J］.Viruses，2013，5（8）：1991-2004.

［14］Duarte M，Laude H.Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus［J］.J Gen Virol，1994，75（5）：1195-200.

［15］Lee D K，Park C K，Kim S H，et al.Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］.Virus Res，2010，149（2）：175-182.

［16］Chen J，Liu X，Shi D，et al.Detection and molecular diversity of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus in China［J］.Viruses，2013，5（10）：2601-2613.

［17］孙东波.猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选［D］.北京：中国农业科学院，2011.

［18］孙东波，冯 力，陈建飞，等.猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定［J］.病毒学报，2007，23（3）：381-384.

［19］Sun D B，Feng L，Shi H Y，et al.Spike protein region（aa 636789）of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies［J］.Acta Virol，200，51（3）：149-156.

［20］Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein［J］.Protein Expr Purif，2005，41（2）：378-383.

［21］董丽娜，高凤山，许崇波，等.表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定［J］.畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747.

［22］LI B X，GE J W，LI Y J.porcine aminopeptidase N is a functional receptor for the PEDV coronavirus［J］.Virology，2007，365（1）：166-172.

［23］Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants protein［J］.Protein Expr Purif，2005，41（2）：224-229.

［24］Madu I G，Belouzard S，Whittaker G R.SARS-coronavirus spike S2domain flanked by cysteine residues C822and C833 is important for activation of membrane fusion［J］.Virology，2009，393（2）：265-271.

［25］Chen X，Zeng L，Yang J，et al.Sequence heterogeneity of the ORF3gene of porcine epidemic diarrhea viruses field samples in Fujian，China，2010-2012［J］.Viruses，2013，5（10）：2375-2383.

［26］Suo S，Ren Y D，Li G X，et al.Immune responses induced by DNA vaccines bearing Spike gene of PEDV combined with porcine IL-18［J］.Virus Res，2012，167（2）：259-266.

［27］Ge J W，Liu D Q，Li Y J.Construction of recombinant lactobacilli expressing the core neutralizing epitope（COE）of porcine epidemic diarrhea virus and a fusion protein consisting of COE and Escherichia coli heat-labile enterotoxin B，and comparison of the immune responses by orogastric immunization［J］.Can J Microbiol，2012，58（11）：1258-1267.

［28］Bae J L，Lee J G，Kang T J，et al.Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen［J］.Vaccine，2003，21（25-26）：4052-4058.

［29］焦 阳，姜 焱，王凯民，等.猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立［J］.动物医学进展，2013，34（8）：71-75.

［30］Zhao J，Shi B J，Huang X G，et al.A multiplex RT-PCR assay for rapid and differential diagnosis of four porcine diarrhea associated viruses in field samples from pig farms in East China from 2010to 2012［J］.J Virol Meth，2013，194（1-2）：107-112.

［31］Kim S Y，Song D S，Park B K.Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR［J］.J Vet Diagn Invest，2001，13（6）：516-520.

［32］Knuchel M，Ackermann M，Muller H K，et al.An ELISA for detection of antibodies against porcine epidemic diarrhoea virus（PEDV）based on the specific solubility of the viral surface glycoprotein［J］.Vet Microbiol，1992，32（2）：117-134.

［33］Cao L，Qin Z，Ge X，et al.Generation of a monoclonal antibody to S1protein of porcine epidemic diarrhea virus［J］.Monoclon Antib Immunodiagn Immunother，2013，32（5）：371-374.