刘翠翠，魏小娟，张继瑜，王 婧，周绪正，李 冰，李金善，牛建荣

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兽药重点开放实验室，甘肃兰州730050）

志贺菌（Shigella）在19世纪末被确定为人类及灵长类动物细菌性痢疾的致病原。根据《中华人民共和国传染病防治法》，由志贺菌属引起的传染病列为乙类传染病。卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》中志贺菌属被列为第3类病原微生物。抗生素类药物能对细菌性痢疾起到很好的治疗效果，但是长期使用甚至滥用会导致细菌耐药性的产生，给临床治疗增加了难度。

研究发现细菌基因组中存在着一种新型的RNA，与常规的tRNA、rRNA和mRNA不同，有其特殊的性质和功能，例如影响细菌的个体发育、翻译激活与抑制细菌毒性、耐药性等，一个单独的小RNA就能调控大量的基因并对细胞生理产生深远影响［1-2］。研究者利用生物信息学预测技术、全基因组分析技术和高通量RNA测序技术等，在志贺菌中大约发现了60多种调控小RNA，其中大部分与大肠埃希菌基因组中的小RNA是相似的，但是对其特性和功能的研究并不透彻。

1 细菌调控小RNA

研究发现，细菌基因组中存在着一种新型的RNA，分子大小约为50bp～400bp，大多数位于编码基因的间区，开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，终止于不依赖Rho因子的转录终止子［3］，还有一小部分sRNA（目前确认只有RyeB和SraC/RyeA）是从mRNA的头部或尾部非翻译区剪切下来的。这类RNA最初被称作非编码小RNA，但是最新研究发现某些sRNA也可以编码一些小的蛋白质，例如SgrS、RNA Ⅲ［4-5］等。因此，这种 RNA分子被称作调控小 RNA［6］。

1.1 分类及功能

根据生物学功能及作用机制可将sRNA分为3类：①具有持家功能的小RNA；②与蛋白质相互作用影响蛋白质功能的小RNA；③与目标mRNA配对结合调控基因表达的小RNA［7］。

根据其基因与靶标的位置关系可分为2类，即正义编码的小RNA和反义编码的小RNA。其中正义编码的小RNA基因与靶标基因重叠，并且它们的转录体之间存在良好的碱基配对；而反义编码的小RNA基因与靶标基因是分离的，通常转录体之间不存在良好的碱基配对［8］。

调控小RNA在细菌中所起的作用很广泛，它们涉及到的功能包括从结构调节到催化作用，影响各种加工过程，如质粒复制、细菌毒性、耐药性、压力反应、发育控制、翻译激活与抑制、RNA剪切和修饰、mRNA稳定性及蛋白质降解等［9］。

1.2 Hfq简介

Hfq是一种热稳定蛋白，由Hfq基因编码，也被称作HF-1，是细菌中最丰富的RNA结合蛋白之一。其大小在各个菌种中有所不同，如大肠埃希菌中的Hfq蛋白是由102个氨基酸组成，而金黄色葡萄球菌中的Hfq蛋白长度为77个氨基酸［10］。

Hfq是通过寡聚体化形成的六元环状蛋白，在结构和功能上与古细菌和真核生物的Sm蛋白类似，因此可称为类Sm蛋白，区别在于Sm蛋白是七聚体［10］。这类蛋白可以通过与RNA的AU富集区相互作用来调节许多RNA参与的反应。研究证实很多细菌调控小RNA都需要Hfq的辅助才能正常发挥作用。Hfq通过碱基配对与调控小RNA（DsrA、RyhB、Spot42 和 OxyS）相 互 作 用［11-13，15］。Hfq也可以作为分子伴侣参与大多数sRNA-mRNA的相互作用，但机制还不是很明确［14-15］。

2 志贺菌调控小RNA

迄今为止，志贺菌中大约有60多种小RNA被发现，约21个sRNA结合到Hfq蛋白发挥作用。2011年，Peng J等［16］对已鉴定的与志贺菌保守相关的64种小RNA通过机器和芯片分析、RT-PCR及Northern blot发现，在福氏志贺菌301大质粒中鉴定出了9种小RNA和256个可能包含小RNA基因的区域。但是对于这些小RNA的功能以及在志贺菌体内的作用机制研究还不透彻，目前只有2种，即RnaG和RyhB的功能研究比较清楚。

2.1 RnaG

福氏志贺菌的毒力基因icsA（也称作virG）编码一种膜外蛋白质，大约有1 102个氨基酸残基，能够引起宿主肌动蛋白在细胞的一端聚合，导致肌动蛋白“尾巴”的形成，驱使细菌在细胞之间移动，引发各种菌痢症状［17-18］。

Giangrossi M等在福氏志贺菌virA-icsA的基因间区发现了一种新型基因RnaG，这是在福氏志贺菌的毒力质粒上发现的第1个sRNA。RnaG是一种反义RNA，分子大小约为450bp，通过2种机制调节毒力基因icsA的转录，即转录干扰和转录弱化：①RnaG启动子的沉默可以使icsA启动子有较高的活性；②RnaG在icsA mRNA的互补链上被顺式转录，当RnaG结合在icsA转录物上时，可以在mRNA的5′端形成茎环结构，促使一个错误的内在终止子形成，使转录异常终止［19］，从而使细菌的毒力受到抑制。

2.2 RyhB

RyhB是一种90个核苷酸的非编码小RNA，由3个模块部分构成，与靶mRNA的序列反向互补的配对结合区域、Hfq蛋白的结合区域和一段不依赖Rho因子的转录终止末端。其生物功能主要体现在对细胞内铁代谢的调控和对致病菌致病力的调节两个方面［20］。

志贺菌对铁的调控依赖铁吸收调控蛋白-Fur蛋白，通过负调控sRNA分子RyhB来间接调控细菌内储铁蛋白基因（bfr）和细胞内那些含铁的非必需元件基因sodB、sdhC、fumA的表达。RyhB通过与上述基因的mRNA配对结合，降低mRNA的稳定性和翻译效率，使表达受到抑制，也可通过与RNase E形成降解复合体对这些mRNA进行降解，减少体内铁的储存和消耗［21］。

RyhB可以通过影响福氏志贺菌的耐酸程度而调节其致病能力，由于此菌长期生存在肠道的酸性环境下，于是产生了一套耐受酸性环境的系统。RyhB可以通过调节ydeP基因的表达水平来调节福氏志贺菌的耐酸性。ydeP基因编码一种氧化还原酶，被认为是耐酸性细菌中所必需的，而ydeP的表达依赖于转录激活因子EvgA的表达，RyhB可以负调控转录激活子EvgA的表达进而影响ydeP的表达。研究表明，当RyhB的表达上调时，福氏志贺菌的耐酸程度显著性降低，同时其致病能力也会明显减弱；相反当RyhB的表达受到抑制时，福氏志贺菌则表现出很高的耐酸性，存活率和致病率也相应的提高［22-23］。

在志贺菌中，RyhB可以负调控许多毒力基因的表达，例如Ⅲ型分泌器、分泌的效应蛋白和一些特定的分子伴侣［24］。志贺菌毒力相关基因的表达受转录激活子virB的调控，当VirB蛋白结合到它们的启动子后，致病力基因的表达增强［25］。RyhB通过负调控转录激活子VirB的表达，使多种致病力基因表达降低。因此，当RyhB表达升高时，志贺菌的菌斑形成能力和对肠表皮细胞的侵袭能力会明显降低［24，26］。

2.3 SraB

2001年，Argaman L 等［27］使 用 Northern blot技术确认了SraB在大肠埃希菌中的存在和表达，其大小为170bp，是在所有假定的sRNA中第1个被鉴定出的基因。大肠埃希菌和志贺菌的SraB序列是高度保守的，相似性大约为99%～100%。但是与沙门菌只有82%的相似性［28］。

在痢疾志贺菌生长的对数期和稳定期，脱氧胆酸（DOC）或者铁的存在可以导致sraB表达的微小上调，但不明显。温度明显影响sraB的表达，即30℃时比37℃的表达上调，因为37℃是宿主体内温度，也是毒力基因表达的最适温度［29］。

蛋白组学分析显示，与生理水平的SraB相比，SraB过多可以导致约61个蛋白质不同程度的上调或者下调。许多上调的蛋白三羧酸循环和柠檬酸循环。对细菌的毒力和入侵有很大作用的IpaA、IpaD等有明显的下调，这说明过多的SraB可以降低痢疾志贺菌的入侵和感染能力［29］。

SraB调节转录过程的机制尚不明确。

2.4 其余小RNA

细菌非编码小RNA的研究主要集中在大肠埃希菌等模式生物，而致病菌非编码小RNA的研究较少。研究证实，志贺菌属与大肠埃希菌K12菌株（MG1 655）基因组中的小RNA大部分是相似的［30］。

DsrA是由87个核苷酸构成的非编码RNA，大约有5种细菌的DsrA RNA序列已知，分别是大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、肠沙门菌、宋内志贺菌和福氏志贺菌，其中大肠埃希菌与2种志贺菌的序列相似性为99%左右［31］。

SraL也称作RyjA，是一种反义小RNA，长度在140bp左右，可以在大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌表达。Silva I J等［32］使用BlastN技术对其他肠道细菌的基因组进行了研究，证实这种小RNA在志贺菌属、柠檬酸杆菌属等体内是高度保守的。

肠道细菌中至少编码8种调控外膜蛋白的小RNA （InvR、MicA、MicC、MicF、OmrAB、RseX和RybB），Vogel J等［33］使用BlastN技术研究发现，其中有6种存在于福氏志贺菌中，MicA、MicC、MicF、OmrAB和RybB，与大肠埃希菌类似。

除此之外，志贺菌属基因组中还有很多与大肠埃希菌同源的及正在研究的非编码小RNA，虽然科学家在细菌中发现了这些小RNA，但是对其功能及在志贺菌体内的作用机制研究还不透彻。

3 前景与展望

志贺菌是一类可以引起人和其他哺乳类动物细菌性痢疾的革兰阴性杆菌，目前最好的治疗方法依然是使用抗生素类药物，但是长期使用和滥用会导致细菌耐药性的产生，给临床治疗增加难度。

随着分子生物学技术的飞速发展和各种非编码小RNA的大量发现，从而引起科学家对小RNA研究的热潮。复旦大学研究人员发现了一种新型核糖开关——氨基糖苷结合核糖开关，广泛分布在具有抗生素耐药性的细菌病原体中［34］，其中核糖开关是一类非编码RNA元件。中国科技大学、华中科技大学和台湾国立清华大学的研究人员共同证实，2种大肠埃希菌内源性非编码RNA-OxyS和DsrA通过调控基因表达影响了线虫的生理学功能［35］。

志贺菌基因组内已经发现了大概60多种非编码小RNA，而且多数与大肠埃希菌K 12菌株基因组中的小RNA是同源的，但是对于它们的功能及在志贺菌体内的作用机制研究还不透彻，目前只有RnaG和RyhB的功能研究比较清楚。希望未来可以明确志贺菌的致病机理，并探索志贺菌的毒性、耐药性与小RNA之间的关系，为痢疾药物开发提供新的作用靶标，为痢疾杆菌疫苗研制提供一个新的思路。

［1］Gottesman S.Micros for microbes：non-coding regulatory RNAs in bacteria［J］.Trends Genetics，2005，21（7）：399-404.

［2］Hershberg R，Altuvia S，Margalit H.A survey of small RNA encoding genes in E.coli［J］.Nucleic Acid Res，2003，31（7）：1813-1820.

［3］Livny J，Waldor M K.Identification of small RNAs in diverse bacterial species［J］.Curr Opin Mcrobiol，2007，10（2）：96-101.

［4］Gottesman S，Storz G.Bacterial small RNA regulators：versatile roles and rapidly evolving variations［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，doi：10.1101/cshperspect.a003798.

［5］Vanderpool C K，Balasubramanian D，Lloyd C R.Dual-function RNA regulators in bacteria［J］.Biochimie，2011，93：1943-1949.

［6］Cao Y，Wu J，Liu Q，et al.SRNATarBase：a comprehensive database of bacterial sRNA targets verified by experiments［J］.RNA，2010，16：2051-2057.

［7］生秀梅，徐顺高，张海方，等.细菌小RNA的研究［J］.生命的化学，2010，30（6）：815-820.

［8］Li Wuju，Ying Xiaomin，Lu Qixuan，et al.Predicting sRNAs and their targets in Bacteria［J］.Genomics Proteomics Bioinformatics，2012，10：276-284.

［9］宋 兰，周先礼，岳俊杰，梁 龙，等.细菌中的小RNA［J］.生物技术通讯，2008，19（4）：587-590.

［10］宋 兰，周先礼，岳俊杰，等.细菌sRNA伴侣蛋白 Hfq的研究进展［J］.军事医学科学院院刊，2009，33（2）：186-189.

［11］Sledjeski D，Whitman C，Zhang A.Hfq is necessary for regulation by the untranslated RNA DsrA［J］.J Bacteriol，2001，183：1997-2005.

［12］Massee E，Gottesman S.A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：4620-4625.

［13］Mller T，Franch T，Hjrup P，et al.Hfq：a bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction［J］.Mol Cell，2002，9：23-30.

［14］Moll I，Leitsch D，Steinhauser T，et al.RNA chaperone activity of the Sm-like Hfq protein［J］.EMBO Rep，2003，4：284-289.

［15］Zhang A，Wassarman K M，Ortega J，et al.The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs［J］.Mol Cell，2002，9：11-22.

［16］Peng J，Yang J，Jin Q.An Integrated approach for finding overlooked genes in Shigella［J］.PLoS One，2011.DOI：10.1371/journal.pone.0018509.

［17］Bernardini M L，Mounier J，d＇Hauteville H，et al.Identifica-tion of icsA，aplasmid locus of Shigella flexneri that governs bacterial intra-and intercellular spread through interaction with F-actin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：3867-3871.

［18］Goldberg M B.Actin-based motility of intracellular microbial pathogen［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2001，65：595-626.

［19］Giangrossi M，Prosseda G，Tran C N，et al.A novel antisense RNA regulates at transcriptional level the virulence gene icsA of Shigella flexneri［J］.Nucleic Acids Res，2010，38（10）：3362-3375.

［20］Geissmann T A，Touat I D.Hfq，a new chaperoning role：binding to messenger RNA determines access for small RNA regulator［J］.EMBO J，2004，23（2）：396-405.

［21］王晨红，杨 光，邵宁生.大肠杆菌中的小RNA调节子［J］.医学分子生物学杂志，2006，3（6）：464-467.

［22］Oglesby A G，Murphy E R，Iyer V R，et al.Fur regulates acid resistance in Shigella flexneri via RyhB and ydeP［J］.Mol Microbiol，2005，58：1354-1367.

［23］程汝滨，苗翠翠，宫倩红，等.细菌非编码小RNA分子RyhB的结构与功能［J］.中国生物化学与分子生物学报，2009，25（7）：590-596

［24］Murphy E R，Payne S M.RyhB，an iron-responsive small RNA molecule，regulates Shigella dysenteriae virulence［J］.Infect Immun，2007，75（7）：3470-3477.

［25］Tobe T M，Yoshikawa M T，Mizuno T C，Sasakawa，et al.1993.Transcriptional control of the invasion regulatory gene virB of Shigella flexneri：activation by virF and repression by H-NS［J］.Bacteriol J，1993，175：6142-6149.

［26］Davis B M，Qui nones M，Pratt J，et al.Characterization of the small untranslated RNA RyhB and its regulation in Vibrio cholerae［J］.J Bacteriol，2005，187（12）：4005-4014.

［27］Argaman L，Hershberg R，Vogel J，et al.Novel small RNA-encoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli［J］.Curr Biol，2001，11（12）：941-950.

［28］Altschul S F，Madden T L，Schaffer A A，et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs［J］.Nucleic Acids Res，1997，25：3389-3402.

［29］Eden Almasude E.Characterization of SraB，a novel small RNA molecule，in the pathogenic bacteriumShigella ［D］.The United States.Ohio University，2011：7.

［30］Skippington E，Skippington R M，Ragan M A.Evolutionary dynamics of small RNAs in 27 Escherichia coli and Shigella genomes［J］.Genome Biol Evol，2011，4（3）：330-345.

［31］Rolle K，Zywicki M，Wyszko，et al.Evaluation of the dynamic structure of DsrA RNA fromE.coli and its functional consequences［J］.J Biochem，2006，139（3）：431-438 .

［32］Silva I J，Ortegaa D，Jesus Silva V S，et al.An RpoS-dependent sRNA regulates the expression of a chaperone involved in protein folding［J］.RNA，2013，19：1253-1265.

［33］Vogel J，Vogel P K，Papenfort K.Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane［J］.Curr Opin Microbiol，2006，9：605-611.

［34］Serganov A，Nudler E.Alexander serganov，evgeny nudler a decade of riboswitches［J］.Cell，2013，152：17-24.

［35］Liu H，Wang X，Wang H D，et al.Escherichia coli noncoding RNAs can affect gene expression and physiology of Caenorhabditis elegans［J］.Nat Commun，2012，3：1073.