贺会利，魏小兵，欧长波，徐 敏，闫艺婷，刘明成，勾肖晶，刘兴友＊

（1.河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003；2.畜禽智能化清洁生产河南省工程实验室，河南新乡453003；3.动物病毒病防控与药残分析河南省重点学科开放实验室，河南新乡453003）

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）最早由美国Schalk和Hawn报道，1936年Beach和Schalm确定该病原为病毒，后命名为鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），归入冠状病毒科冠状病毒属的第3群［1］。患病鸡以咳嗽﹑喷嚏和气管啰音的呼吸道症状为主。该病存在呼吸型、肾病变型、腺胃型等主要致病型，在我国的流行呈上升趋势，尤其是肾病变型IB已蔓延至全国各养鸡地区，造成了严重的经济损失［2］。李富桂等［3］通过研究表明此病的传染性很强。2011年，Han Zongxi等［4］通过对中国15年的禽IBV分子流行病学分析，强调持续监控IBV的重要性。

1 IBV的基因组结构

IBV的基因组为不分节段的单股正链RNA，其核酸具有侵染性，长为27.6kb，分子质量8MD，其基因组有5′帽子和3′尾巴结构，可转录出6种亚基因组 mRNA（1-6）［5］，至少有10个开放阅读框（open reading frame，ORF）。IBV的mRNA是直接由引物起始转录的，而不是由前体mRNA加工得到的，IBV所有mRNA都具有共同的3末端嵌套式结构。研究发现，前导序列旁侧翼有一段保守的核苷酸序列CCT/GAACAA，它可能是前导序列与mRNA结合的中心区域，并启动mRNA2～mRNA6的转录。另外，基因组RNA端序列与mRNA基因之间的序列都含UAAAC序列。在前导序列3′端有一个反向直接重复序列（UAAU），在其后紧跟着一个倒置重复序列（UUUA），在第55位～72位和80位～143位可能存在2个发夹结构，中间以AU丰富区（AUAAA）隔开，这个片段可能是合成前导序列的终止位点。mRNA 2、4、6为单顺反子结构，分别编码IBV的3个主要结构蛋白，即纤突蛋白、膜蛋白、核蛋白；mRNA 3、5为多顺反子结构，分别含有3个和2个ORF，编码3a、3b、3c及5a、5b这5种小蛋白。病毒RNA各基因的定位次序是5′-F1-F2-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly（A）-3′。IBV 基因组可分为2个部分，即位于5′端的非结构基因和3′端的结构基因。由于IBV基因组的复制酶为RNA聚合酶，缺乏自我修复能力，导致其容易发生点突变、缺失，加上基因片段的插入和同源重组，使其容易发生变异。S1基因序列存在广泛的碱基替换、缺失和插入现象［6］。S1基因的突变可能引起中和抗原位点的改变，导致产生新的血清型，还可能导致IBV的致病原性和组织的侵嗜性改变［7］。早期的分子生物学研究认为，IBV的变异主要发生于S1基因，而N基因则相对保守，研究表明，N基因也易发生变异，其内部同样存在着基因缺失、插入和替代等变异现象，这表明IBV的变异并非一个单独基因的变异，而是整个结构基因的变异，且这种变异在4种结构蛋白基因之间具有相关性。邹年莉对四川2008年-2010年分离到的19株IBV的S1基因进行测序鉴定，并与GenBank上公布的其他参考毒株的相应序列进行了比较分析，19株分离株分别属于4个基因型，15株为LX-4型，为中国和四川地区主要流行毒株；1株为台湾特有的基因型台湾Ⅰ型；1株为具有争议的“腺胃型”；2株为Mass型，是中国地区主要使用的疫苗株的基因型；各基因型间变异距离较远，同源性较低［8］。这可能是目前生产中虽经疫苗免疫的鸡群仍然频繁发生IB的主要有原因之一。

2 IBV的结构蛋白及生物学功能

IBV有4种病毒特异主要结构蛋白，即纤突（S）蛋白﹑膜糖（M）蛋白、内部核衣壳（N）蛋白和E蛋白。

2.1 S蛋白

S蛋白也叫纤突蛋白，是IBV的主要结构蛋白，决定了IBV的抗原性，位于病毒的最外面。由mRNA 2编码，S蛋白由两种糖多肽S1和S2各2个～3个拷贝构成，S1约90ku，由520个～538个氨基酸组成，含有与血凝抑制、病毒中和、组织嗜性、血清型特异性相关的抗原位点，也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白。S2约84ku，由625个氨基酸组成，Cavanagn D证实S蛋白翻译后经过裂解产生S1的N端和S2的C端，两者之间由二硫键连接，S1在外形成一个泡状结构，S2通过一个小的疏水跨膜片段嵌入病毒膜中，形成S1的柄 ，将S1蛋白锚定在膜上，裂解处的氨基酸序列模式为：-Arg-Arg-X-Arg-Arg-C（X为任一氨基酸），裂解位点紧靠第2对Arg，此序列在不同的IBV毒株中是保守的。Jackwood M W等发现IBV S蛋白裂解位点序列可能与IBV来源的区域有关。S蛋白具有信号肽，在翻译时将此插入粗面内质网膜上，S蛋白上有28或29个糖基化位点，其中，S1可能有17个，S2可能有12个。大多数IBV的血清型抗原决定簇主要位于S1蛋白的N端，研究发现在S1蛋白上还有2个额外的抗原决定簇区，分别位于第294位～316位氨基酸处和第532位～537位氨基酸处，S2蛋白也还有一额外的抗原决定簇区，位于第566位～584位氨基酸处，它们可能有保护作用。S2的N端位于囊膜外面，C端位于膜内。S蛋白有很多重要的生物学功能，只有S蛋白被宿主细胞的蛋白酶裂解成S1和S2两个糖多肽时，IBV病毒才能与宿主细胞的细胞膜融合。Cavanagn M A等研究表明，S1蛋白能诱发产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体。闫芳等［9］证实了S1可以激活机体的免疫应答。Casais R等发现S1蛋白具有决定IBV的组织亲和性及其毒力方面的作用。S1蛋白与病毒的免疫保护性有关，也是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白。Collisson E W等发现S1蛋白还能诱导鸡的特异性细胞毒性T细胞应答。Ignjatovic J等发现S1的高变区与中和表位有关。S2蛋白在多数IBV毒株中相对保守，其主要是锚定S1蛋白作用，使S1蛋白诱导产生交叉反应和细胞介导的免疫应答。Collisson E W等研究表明S2糖蛋白可诱发较弱的中和抗体。虽然S2相对保守，但其变异影响与S1之间的相互作用，进而影响S蛋白与IBV特异性的结合。因为S2相对保守，同时S2蛋白诱发产生交叉反应抗体的抗原决定簇具有免疫优势，因此，S2可以用于制作IBV疫苗。

2.2 M 蛋白

M蛋白也叫基质蛋白，由mRNA 4编码，含有224个～225个氨基酸，分子质量为23ku～35ku，M蛋白实际就是横跨囊膜的转膜分子，M蛋白大部分在囊膜内侧，与核衣壳相互作用，仅有10%糖基化的N端暴露于病毒外表面，可能形成抗原决定簇。M蛋白未糖基化时的分子质量约为23ku，随糖基化程度的不同形成一系列分子质量从23ku～34ku不等的蛋白质。M蛋白的N端有2个糖基化位点，其序列高度保守。不同IBV毒株的M基因发生碱基的重组、替换、插入或缺失是引起其N端糖基化位点的差异的原因。囊膜外的M蛋白的变异率高于镶嵌部分的M蛋白。M蛋白可以在粗面内质网或高尔基体膜处聚集，此处是病毒的出芽部位，同时可以在病毒的复制过程中发挥作用，在有补体的情况下可以中和病毒的感染。殷震等发现M蛋白与抗感染﹑诱导白细胞产生α干扰素等有关。Masters P S发现M蛋白参与了S蛋白的定位和病毒样颗粒（VLP）的形成。研究还发现 M蛋白与S蛋白和N蛋白相比，其免疫原性最低。

2.3 N蛋白

N蛋白由mRNA 6编码，分子质量约46ku，N蛋白位于病毒粒子的内部，是一种由409个氨基酸残基组成的碱性磷酸化蛋白质，被磷酸化后的分子质量约51ku，其氨基酸组成中约有17%为碱性氨基酸，其中包括199个His、42个Lys和3个Arg。N蛋白是唯一位于膜内的蛋白质，与S蛋白相比，其保守性很高。N蛋白缠绕RNA基因组形成核糖核蛋白体（RNP），参与RNA的合成、转录和翻译。在细胞免疫和体液免疫中，N蛋白可以免疫识别相关靶位。Boots A M等发现N蛋白不仅能激活T细胞，而且能提高B细胞产生抗体的能力。Ignjatovic J等研究表明，N蛋白上的抗原决定簇可以产生高于S蛋白的交叉反应抗体，还可以诱导产生特异性CTL应答，后来被Yu L等证实诱导的CTL抗原表位对急性感染的雏鸡有一定的保护作用。2013年Jayaram J［10］进一步证实N蛋白在病毒的复制中起作用。张淑霞等研究表明，N蛋白具有高度的生物活性，有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。早期认为N基因高度保守，N蛋白也被用来作为诊断工具，但Sech J N等研究表明不同IBV毒株N基因之间的变异可使病毒的生物特性发生改变。

2.4 E蛋白

E蛋白或者称小囊膜蛋白（sM），由mRNA 3的ORF3c编码，分子质量为12.4ku。1985年发现IBV基因中存在E基因，1991年发现E蛋白。E蛋白以很少的量结合在囊膜上，可能与病毒子形成有关。Corse E等证实E蛋白在病毒的复制过程中，参与病毒样颗粒（VLP）形成和病毒出芽。VLP在IBV的黏膜免疫中起作用。E蛋白编码一段在IBV株间高度保守的序列CTTAACAA，这段序列与M基因的转录有关。E蛋白有组装病毒的功能和感染细胞的凋亡有关。Boursnell等研究发现E基因是以IBV为代表的冠状病毒属抗原Ⅰ群和Ⅱ群区别于其他冠状病毒抗原Ⅲ群的主要标志之一。Marta L D等研究发现E蛋白并不是病毒复制必需的，但是它影响病毒生长，缺失E蛋白导致病毒的复制滴度比野生型感染性克隆低100倍以上。

3 分子生物学诊断技术与分子流行病学研究

3.1 反转录-多聚酶链反应（RT-PCR）

RT-PCR具有特异、快速、实用、安全等优点，适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。1992年Jackwook M W等应用RT-PCR技术对5个血清型的8株IBV进行检测，结果这8株病毒均被检出。1994年王林川等用RT-PCR技术检测了广东分离的IBV。Jahantigh M等［11］利用RT-PCR技术证实在扎布尔存在IBV Mass型。RT-PCR在基因测序、基因表达、反向遗传的研究中也得到应用。赵芳芳［12］应用RT-PCR方法对Sczy3分离株基因组全序列进行测定，结果表明Sczy3分离株具有典型的禽状病毒基因序列特征。张小荣［13］采用RT-PCR的方法从mRNA水平鉴定重组病毒rMDV-Sl能够正确表达S1基因。周生等［14］应用RT-PCR方法通过反向遗传操作技术构建了H120疫苗株的全长cDNA感染性克隆。

RT-PCR在确定分离株的血清型也得到广泛的应用。1996年Adzhar A等首次扩增出IBV Mass型的特异性引物，随后1997年Cavangh D等设计并扩增出793/B、荷兰株D274、Mass型特异的引物。1999年，刘思国等设计了传染性支气管炎病毒疫苗株的特异性引物，将此毒株与其他的流行株区分开。此种方法可以确定传染性支气管炎暴发中的主导血清型，这对选择使用合适的疫苗或开发针对此血清型的新疫苗有极大的作用，目前这种方法的缺点是特异性引物不多，这就使这种方法应用受到限制，但是随着不断的研究会克服此缺点，使此项技术得到更好地应用。RT-PCR自身也有缺点，由于弱毒疫苗株在宿主体内的复制，导致出现假阳性结果，影响对疫病的判断。

3.2 限制性酶切片段多态性技术（RFLP）

RFLP技术是利用限制性酶对不同个体的基因组DNA进行切割，根据含同源序列的酶切片段在长度上存在的差异进行鉴定。1993年Kwon H M等首次对11个IBV参考株的S1全基因产物用HaeⅢ﹑XcmⅠ﹑BstYⅠ3种酶进行酶切分析，结果显示 HaeⅢ酶可使 Holte、Ark、DPI、SE17、Md27、Iowa97与其他IBV区别开来。1997年步志高等利用该技术对国内不同地区的8株IBV进行分析，确定了各毒株的基因型。2012年Sumi V等［15］采用RFLP技术首次证实在印度存在793/B型IBV。RFLP技术重复性好，但对DNA的量要求大﹑步骤繁琐﹑检出率低，提供的信息有限。

3.3 寡核苷酸序列图谱分析（ONF）

此方法是根据不同的血清型具有不同的核苷酸指纹图谱这一事实为依据来分析的。其原理是从纯化的IBV中提取核酸，经T1核糖核酸酶消化后，用32P标记，然后将混合物先后在10%、20%聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直双向电泳，放射自显影后，根据图谱上的斑点进行分析。1990年Butcher G D等利用该方法对鸡胚上分别传代10、100代的T株Ark DPI株和M41株进行分析，结果显示它们的图谱都有差异。这种方法具有灵敏度高，重复性好，而且可以鉴别同一血清型的不同毒株，但是此方法只有当样品的基因序列同源性在95%以上才有一定的价值［16］。

3.4 核酸探针技术

应用标记技术制备放射性标记或生物素标记的核酸探针，检测IBV。该技术具有敏感﹑特异﹑快速等优点。TDK Brown T D K等最早运用P标记的IBV的cDNA以检测IBV的RNA。Jackwood M W等用核酸探针技术检出的最小IBV的量为125ng。1993年Kwon H M等研究表明核酸探针技术与电镜观察法（EM）相比较，此方法敏感度比EM高。2007年孟凡磊等制备的地高辛标记的IBV核酸探针对IBV的最低检出量为10pg。

3.5 分子流行病学

近年来，IBV在国内的流行日趋严重，已经成为对我国养鸡业危害最为严重的病毒性传染病之一。本病的易感动物主要是鸡，各种日龄与品种的鸡均易感。IBV自然感染通常在48h内出现症状；人工接种后的1d～7d都能检测到该病毒。IBV的流行具有地域性，这一特点就决定了IB疫苗的研制和使用应针对特定地区流行的特定型的IBV［17］。张小荣［13］研究表明目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株是 QX型、LSC/99I型、793/B型、LDL/97I型和TWⅠ型，除此之外新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次以上的同源重组而产生的。鸡群IBV的流行具有遗传多样性，并不断发生变异和进化；虽然新的IBV毒株不断出现导致鸡群长期受IB困扰，但没有出现新的优势流行毒株，现用疫苗还有一定的免疫保护效果［18］。

4 反向遗传技术的应用

反向遗传学技术是直接从生物的遗传物质入手，利用现代生物学理论与技术，采用“基因→性状”的研究路线，研究生物体遗传和变异规律，揭示生物的表现型与基因型之间的关系，进而来阐述生物生命发生的本质现象。自1978年第1例RNA病毒Q β噬菌体的成功拯救以来，各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展。IBV由于基因组比较大，病毒传代易变异，病毒的复制酶cDNA在细菌中不能稳定存在，从而使其全长cDNA无法转录。随着大多数单股正链RNA病毒通过反向遗传技术成功获得拯救，冠状病毒于2000年在体外拯救获得成功。2001年Casais R等利用痘病毒载体成功构建了IBV的反向遗传学操作系统。2003年，Casais R等应用反向遗传学技术发现IBV组织嗜性的决定因子是S蛋白；2006年Tan等应用反向遗传操作技术研究发现N蛋白与RNA的结合对于维持病毒的感染性非常重要。2013年Zhou Y S等［19］利用反向遗传技术建立了传染性支气管炎H120弱毒疫苗株。反向遗传学操作系统的成功构建为全面研究IBV的基因组、结构蛋白和致病机制提供了技术平台，为基因工程疫苗和药物的研发具有巨大的推动作用，为防控传染性支气管炎奠定了基础。

5 展望

IBV较高的基因突变率造成了IBV的血清型复杂［20］，大量的试验表明IBV的血清型达到30多种，并仍有不断上升的趋势，各血清型或毒株之间交叉保护性较弱，从而给本病的防控带来较大的困难，因此对IBV进行实时动态监控和防控成为科学工作者的重要研究方向。目前，虽然表达主要免疫原基因的不同表达系统对IBV都有部分保护作用，但大多数IBV基因工程疫苗免疫保护率比传统IBV疫苗免疫效果偏低，还需进一步研究［13］。

研究表明，IBV的宿主范围已经在逐渐扩大，这种宿主适应性的分子机制还不清楚；IBV的基因与功能之间的相互关系还不完全明白，特别是基因变异对IBV的宿主范围、血清型以及流行病学方面的影响有待更深的研究；传统疫苗一个不容忽视的弱点就是不能区分野毒感染与疫苗免疫，标记疫苗也是IBV未来的研究方向。而IBV反向遗传操作系统的建立为IBV的进一步研究提供了技术支撑，便于研究者对IBV基因组结构、基因功能﹑致病机制以及基因工程疫苗等方向的研究。

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