张丽芳，李伟岭，江兆玲，王 米，郑文丽，薛飞群

（中国农业科学院上海兽医研究所中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室农业部寄生虫病学重点开放实验室，上海 闵行区200241）

食品安全是目前全球最关注的一大热点，农药和兽药的不合理使用甚至滥用导致食用农产品残留超标，已成为食品安全的突出问题之一，开发可靠、灵敏、快速和实用的快速分析检测技术无疑是监测和控制残留、保障人民身体健康和避免国际间贸易争端的重要前提。而免疫分析技术特别是酶联免疫吸附分析技术作为一项快速检测技术，以其抗原抗体反应的高专属性，测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农药兽药残留分析和环境检测中展示了广泛的应用前景[1-4]。

免疫分析法是利用抗原和抗体的结合反应的检测方法，而大多数农药和兽药都是小分子物质（也叫半抗原），相对分子质量在1 000 Da以下，它缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性的抗体，但把它以共价键方式偶联到大分子蛋白载体上制备成人工抗原(也称偶联物)后，可借助其T细胞来间接诱导B细胞的增殖与分化，产生特异性的抗体，这也是小分子免疫分析的基本模式。在这项技术中，鉴定人工抗原（半抗原-载体蛋白偶联物）是否偶联成功是建立免疫分析方法的前提和关键所在。目前半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定方法主要有紫外分光光度法[5]、红外分光光度法[6]、电泳法[7-9]和基质辅助激光解吸飞行时间质谱法[10-11]等等，到目前为止还没见荧光光谱法应用于半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定中的文献报道。

目前荧光光谱法主要应用于小分子与蛋白或其他生物大分子以非共价键相互作用方面的研究，而人工抗原是小分子半抗原与载体蛋白以共价键结合得到的偶联物。本文以苯甲酸和苯胺为小分子半抗原分别与载体蛋白牛血清白蛋白进行偶联，开展半抗原-载体蛋白偶联物的荧光光谱鉴定的初步研究，试图建立一种新的半抗原-载体蛋白偶联物鉴定的新方法。

1 仪器与试剂

荧光分光光度计（F-2500，日本日立公司）。所有试剂均为分析纯试剂（市售）。

2 半抗原－载体蛋白偶联物的制备

2.1 苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物的制备 称取0.12 g（1mmol/L）苯甲酸，加3mL 1，4-二氧六环，于4℃下加入0.14 g（1mmol/L）三丁胺和00.14 g(1 mmol/L)氯甲酸异丁酯搅拌30min，此为甲液。

称取0.66 g（0.01mmoL）牛血清白蛋白（BSA）加50%二氧六环水溶液，此为乙液。将甲液滴加入乙液，4℃下搅拌过夜。将反应液转移入透析袋，用磷酸pH缓冲液（pH值7.4）透析3 d，每天换液2次。取透析袋中絮状物，真空冷冻干燥即得白色固体。

2.2 苯胺-牛血清白蛋白偶联物的制备 称取0.09 g（1mmol/L）苯胺，加3mL 1mol/L盐酸，冰浴下搅拌滴加入1%NaNO2水溶液至淀粉碘化钾试纸变蓝，此为甲液。

称取0.66 g（0.01mmol/L）牛血清白蛋白（BSA）加15mL碳酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH值9.6）水溶液溶解，此为乙液。于4℃下将甲液滴加入乙液，4℃下搅拌过夜。将反应液转移入透析袋，用磷酸pH缓冲液（pH值7.4）透析3 d，每天换液2次。取透析袋中絮状物，真空冷冻干燥即得棕色固体。

3 荧光光谱测定

分别取牛血清白蛋白、苯胺、苯甲酸、苯胺-牛血清白蛋白偶联物和苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物适量加50%甲醇水溶液溶解成各试液，取各试液分别置于1 cm石英比色液池中，设置空白溶剂为50%甲醇水溶液，激发波长为278 nm,激发和发射单色仪的狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为300 nm/min，扫描范围320～500 nm等条件进行荧光发射光谱扫描测定。

4 结果与讨论

4.1 激发波长的确定 牛血清白蛋白因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等具有荧光特性的氨基酸而显示有荧光特征，苯甲酸和苯胺并不具有荧光特征，因此本文首先通过固定激发波长来扫描牛血清白蛋白的发射光谱和固定发射波长扫描牛血清白蛋白的激发光谱，摸索最佳的激发波长，结果发现在激发波长278 nm下，牛血清白蛋白的荧光发射强度最强，为苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物的鉴定奠定基础。

4.2 荧光光谱分析 图1是牛血清白蛋白和苯胺-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱图。从图1中可看出，苯胺-牛血清白蛋白偶联物的最大发射波长在350 nm，与牛血清白蛋白、苯胺及其两者的混合物相比发生了明显的位移，表明苯胺已被成功偶联到牛血清白蛋白上了。

图1牛血清白蛋白及其苯胺-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱

图2是牛血清白蛋白和苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱图。从图2中可看出，苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物的最大发射波长在320 nm处，其荧光发射图谱与BSA及BSA与苯甲酸混合物的荧光光谱略有区别，因此也能断定，苯甲酸已与牛血清白蛋白成功偶联。

图2牛血清白蛋白及其苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱

在人工抗原的制备中，小分子以特定的基团（如氨基-NH2、羧基-COOH等等）通过相应的反应连接到载体蛋白上。本研究中，苯胺通过氨基的重氮化法与牛血清白蛋白上的色氨基酸、酪氨基酸残基等偶联。由于牛血清白蛋白产生荧光主要也是这些氨基酸贡献的，一旦有其他基团连接上后，就改变了原来的荧光光谱特性。因此苯胺-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱与其载体蛋白牛血清白蛋白的荧光光谱区别很大；而苯甲酸是通过其羧基以混合酸酐法与牛血清白蛋白上的伯氨基形成酰胺键而偶联，因此其偶联物的荧光光谱与其载体牛血清白蛋白的相比变化不大，只是在荧光发射强度上有一定的区别。

5 结论

经过荧光光谱法鉴定结果初步表明，苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物合成成功。荧光光谱法简单、快速且灵敏，可望成为小分子-载体蛋白偶联物鉴定的有效方法。

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