彭友舜，韩占霞，李嘉明

(1河北科技师范学院化学工程学院，河北秦皇岛，066600;2河北省芦笋工程技术研究中心)

芦笋(Asparagusofficinalis L.)，学名石刁柏，是百合科天门冬属多年生草本植物，其营养价值高于一般蔬菜水果，在国际市场上被称为“蔬菜之王”。药理学研究表明芦笋多糖对高脂血症、糖尿病、癌症等有一定疗效［1］，具有较高的营养和药用价值［2～4］，而且大多数活性较小，在预防疾病上优于其他化合物，具有广阔的应用前景。

植物多糖中含有色素、蛋白质等物质，对其活性造成影响，因此脱色是多糖的提取、分离、纯化及结构研究中的一个重要环节。目前多糖脱色多采用双氧水法和活性炭吸附法，如卢国勇等［5］采用过氧化氢对鱼腥草多糖脱色，杨培民等［3］利用活性炭对白花蛇舌草多糖溶液进行脱色。双氧水通过氧化色素实现脱色目的，容易造成多糖降解。活性炭(粉炭)有巨大的比表面积，对杂质的吸附能力很强，脱色成本低，效果好，且不会影响提取物的生物活性［6］。受秦皇岛长胜农业科技有限公司委托，笔者进行了单因素及均匀设计试验，对芦笋多糖活性炭脱色的最佳工艺条件进行研究，以期为芦笋多糖工业化生产脱色工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦笋粗多糖，引自秦皇岛长胜农业科技有限公司芦笋生产基地;粉末活性炭，引自天津市风船化学试剂科技有限公司;牛血清蛋白CBBG250，引自西安周鼎国生物技术有限责任公司;考马斯亮蓝G-250，引自国药集团化学试剂有限公司;D-无水葡萄糖，引自中国药品生物制品检定所，批号为110833-200503;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

HZQ-QG恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司出品;722s可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司出品;FE-20精密pH酸度计，上海微川精密仪器有限公司出品;JA5003型电子天平，上海方瑞仪器有限公司出品;720060型和720110型手动单道可调式移液器，上海大龙医疗器械有限公司出品;雷磁pHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司出品;800型离心机，江苏宏凯仪器厂出品。

1.3 方法

1.3.1 芦笋粗多糖溶液的制备 称取1 g芦笋粗多糖粉末，加蒸馏水溶解定容至100 mL，即为质量浓度10 g/L的芦笋粗多糖样品溶液。

1.3.2 脱蛋白率的测定 蛋白质含量的测定采用Bradford法［7］。

质量浓度为0.10 g/L的考马斯亮蓝储备液的制备:称取0.100 g考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL体积分数为0.95的乙醇，加入100 mL体积分数为0.85的磷酸，用蒸馏水定容至1 L，摇匀，备用。

标准曲线的绘制:精密移取 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL 的牛血清蛋白标准溶液，依次置于11个20 mL的具塞试管中，各加蒸馏水至1.0 mL，再分别加入质量浓度为0.10 g/L的考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL，充分摇匀后，静置15 min，于波长595 nm处测定溶液吸光度值。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制得蛋白质标准曲线。

样品溶液中蛋白质含量的测定:精密量取样品溶液1.0 mL，加入考马斯亮蓝储备液5.0 mL，振摇，以1.0 mL水作为空白，静置15 min后于595 nm处测定吸光度值。按(1)式计算脱蛋白率:

W1——脱蛋白率;C1——处理前溶液中的蛋白质的质量浓度;C2——处理后溶液中的蛋白质的质量浓度。

1.3.3 多糖保留率的测定 多糖的测定采用苯酚-硫酸法［8］。

质量浓度为50.0 g/L的苯酚溶液的配制:精确称取苯酚5.0 g，加入少量蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容后其置于棕色试剂瓶中备用。

1.0 g/L葡萄糖标准溶液的配制:准确称取105℃下干燥至恒重的标准葡萄糖0.5 g，加少量蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配得质量浓度为5.0 g/L葡萄糖母液。用移液器精密移取5.0 mL葡萄糖母液至25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，备用。

标准曲线的绘制:精确移取0，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL 的标准葡萄糖溶液，依次置于6 个20 mL的具塞试管中，分别加蒸馏水至1.0 mL，之后加入质量浓度为50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及体积分数为0.98的浓硫酸5.0 mL，将其充分摇匀后，放入85℃水浴锅中加热20 min，取出，冷却至室温，于波长490 nm处测定溶液吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制得多糖标准曲线。

样品溶液中多糖含量的测定:为消除待测液pH值对显色的影响，测定前用稀盐酸调节粗多糖溶液pH值为6.0。精密量取样品溶液1.0 mL，加入质量浓度为50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，充分摇匀后，放入85℃水浴锅中加热20 min，取出冷却至室温。另以1.0 mL蒸馏水加质量浓度为50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及浓硫酸5.0 mL同上述操作(作为空白对照)，于490 nm处测定溶液吸光度值。根据标准曲线得出溶液中多糖浓度，并按(2)式计算多糖保留率:

W2——吸附结束后溶液中多糖保留率;C0——吸附前溶液中多糖的质量浓度;Ct——吸附后溶液中多糖的质量浓度。

1.3.4 脱色率的测定 取10 g/L芦笋多糖溶液，以蒸馏水作参比进行紫外全波长扫描，结果表明，该溶液无最大吸收波长。由互补色原理可知，溶液呈现的颜色是其吸收光的互补色。芦笋粗多糖溶液为橙黄色，故该溶液主要吸收蓝紫色波段可见光。因此对400～500 nm波长范围内每隔10 nm测定脱色率，计算所测定的脱色率平均值，以脱色率最接近该平均值的450 nm作为测定波长。并按(3)式计算脱色率:

W3——脱色率;A0——吸附前溶液的吸光度;At——吸附后溶液的吸光度。

1.3.5 综合吸附效应指数的计算 整合分析(meta-analysis)是对同一主题下多个独立实验结果进行综合的统计学方法，被认为是目前最好的数量综合方法，其统计量为效应值。为客观评价脱色脱蛋白方法的有效性，引入综合吸附效应指数ζ(0≤ζ≤1)，其物理意义为脱蛋白率、多糖保留率以及脱色率的加权和。ζ为一个无量纲的值，其值越大表明活性炭综合处理能力越好。其计算方法如下:

ζi表征活性炭的综合吸附效应指数;Wij为脱蛋白率(j=1)、多糖保留率(j=2)、脱色率 (j=3)实验数据;X1，X2，X3分别表示脱蛋白、多糖保留、脱色能力的权重。由于本次研究旨在考察活性炭对多糖溶液的脱色能力，但需兼顾处理方法对脱蛋白及对多糖的保留能力，故依重要性设定其值依次为0.2，0.3，0.5。

1.3.6 芦笋多糖活性炭脱色单因素试验

①温度对活性炭吸附性能的影响分别取多糖溶液10.0mL置于三角瓶中，在活性炭质量浓度为15 g/L，pH 值为6的条件下，设置脱色温度分别为30，40，50，60，70，80 ℃，恒温振荡脱色60 min，离心，取上清液，测定吸光度，计算脱色率、多糖保留率、蛋白质脱除率及综合吸附效应指数。

②时间对活性炭吸附性能的影响分别取多糖溶液10.0 mL置于三角瓶中，在温度为70℃，活性炭质量浓度为15 g/L，pH值为6的条件下，设置脱色时间分别为20，30，40，50，60 min，恒温振荡脱色，离心，取上清液，测定吸光度，计算脱色率、多糖保留率、蛋白质脱除率及综合吸附效应指数，确定时间对活性炭吸附性能的影响。

③活性炭质量浓度对活性炭吸附性能的影响分别取多糖溶液20.0 mL置于三角瓶中，在温度为70℃，脱色时间为60 min，pH值为6的条件下，添加活性炭，使多糖溶液中活性炭的质量浓度为5，10，15，20，25，30 g/L。恒温振荡脱色，离心，取上清液，测定吸光度，计算脱色率、多糖保留率、蛋白质脱除率及综合吸附效应指数，确定活性炭质量浓度对活性炭吸附性能的影响。

④pH值对活性炭吸附性能的影响分别取多糖溶液10.0 mL置于三角瓶中，在温度为70℃，脱色时间为60 min，活性炭质量浓度为15 g/L，设置pH值分别为5，6，7，8，9。恒温振荡脱色，离心，取上清液，测定吸光度度，计算脱色率、多糖保留率、蛋白质脱除率及综合吸附效应指数，确定pH值对活性炭吸附性能的影响。

1.3.7 芦笋多糖活性炭脱色均匀设计实验 在单因素试验基础上，对影响芦笋多糖脱色效果的主要因素——温度、时间、活性炭质量浓度、pH值进行均匀设计试验。因素水平见表1。

表1 芦笋多糖活性炭脱色均匀设计试验因素水平

1.3.8 芦笋多糖活性炭脱色验证实验 分别取多糖溶液10.0 mL置于5个三角瓶中，在均匀设计试验最优条件下进行芦笋多糖脱色试验，测定吸光度，计算脱色率、多糖保留率、蛋白质脱除率及综合吸附效应指数。

1.3.9 数据处理 图表中实验数据以平均值表示，ζ值由实验数据的平均值计算得到，数据处理软件为 DPSV6.55，作图软件为 ORINGIN 8.0。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以牛血清蛋白质量浓度(g·L－1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，芦笋蛋白质含量标准曲线回归方程为 y=1.450 0 x﹢0.290 0，R2=0.995 6(图1);以多糖的质量浓度(g·L－1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，芦笋多糖含量标准曲线回归方程为 y=2.897 4 x-0.001 0，R2=0.999 7(图2)。

图1 芦芛蛋白质含量标准曲线

图2 芦芛多糖含量标准曲线

2.2 芦笋多糖活性炭脱色单因素试验结果

2.2.1 温度对活性炭吸附性能的影响 脱色率在脱色温度在30～50℃范围内，随温度升高明显增大，在50℃达到最大，后随温度升高缓慢下降;多糖保留率随温度增加呈先上升后下降趋势，在60℃时达到最高;蛋白质脱除率随温度增加呈先上升后下降趋势，在70℃时达到最高;综合吸附效应指数随温度增加呈先上升后下降趋势，在70℃时达到最大(图3)。参考综合吸附效应指数，确定脱色温度70℃为最佳脱色条件。

2.2.2 时间对活性炭吸附性能的影响 脱色率随时间增加呈先上升后下降趋势，50 min时达到最高;多糖保留率随时间增加呈先上升后下降趋势，在40 min时达到最高;蛋白质脱除率在20～30 min呈上升趋势，在30 min时达到最高，随后达到平衡;综合吸附效应指数随时间增加呈先上升后下降趋势，在40 min时达到最大(图4)。参考综合吸附效应指数，确定脱色时间40 min为最佳脱色条件。

图3 温度对活性炭吸附性能的影响

图4 时间对活性炭吸附性能的影响

2.2.3 活性炭质量浓度对活性炭吸附性能的影响 脱色率在活性炭的质量浓度为5～25 g/L范围内，随用量增加明显增大，随后达到平衡;多糖保留率随用量增加呈不断下降趋势;蛋白质脱除率随用量增加而升高，在活性炭的质量浓度为25 g/L时达到最高，随后下降;综合吸附效应指数随活性炭的质量浓度升高而升高，在活性炭的质量浓度为25 g/L时达到平衡(图5)。参考综合吸附效应指数，确定活性炭的质量浓度25 g/L为最佳脱色条件。

2.2.4 pH值对活性炭吸附性能的影响 脱色率受pH值影响较小，在pH值为7时出现拐点，呈下降趋势;多糖保留率在pH值为5～6时增加显著，随后呈缓慢增加趋势;蛋白质脱除率随pH值增大呈先升高后降低趋势，在pH值为7时达到最高;综合吸附效应指数随pH值增加呈先升高后降低趋势，在pH值为7时达到最大(图6)。参考综合吸附效应指数，确定最佳脱色条件为pH值为7。

图5 活性炭质量浓度对活性炭吸附性能的影响

图6 pH值对活性炭吸附性能的影响

2.3 芦笋多糖活性炭脱色均匀设计实验结果

根据表1设定的因素水平，利用DPSV6.55软件进行均匀设计试验。试验结果见表2，各因变量与各自变量标准回归系数关系见表3，对模型以综合吸附效应指数为目标函数进行求解见表4。

以综合吸附效应指数为目标函数，对试验结果(表2)进行偏最小二乘建模。采用偏最小二乘二次多项式回归分析，其模型如下:

通过对回归系数绝对值(表3)进行比较，4个因素对综合吸附效应指数的影响程度的相对由大到小的顺序为:活性炭质量浓度，时间，温度，pH值。

对模型以综合吸附效应指数为目标函数进行求解，确定各变量最优值(表4)。

表2 芦笋多糖活性炭脱色的均匀设计试验结果

表3 芦笋多糖活性炭脱色各因变量与各自变量标准回归系数关系

2.4 芦笋多糖活性炭脱色验证实验结果

在活性炭的质量浓度为25 g/L，时间60 min，温度80℃，pH值为5.6最佳条件下进行验证实验，综合指标为0.682 4(脱色率为67%，脱蛋白率89%，多糖保留率56%)，与模型所得的目标函数(0.655 8)误差为3.9%，认定该模型有效。

表4 芦笋多糖活性炭脱色最佳提取条件

3 结 论

本试验中，以活性炭为脱色剂，考察活性炭用量、时间及温度等因素对多糖脱色效果的影响。试验结果表明，各因素影响顺序由大到小依次为:活性炭的质量浓度，时间，温度，pH值。其最佳脱色工艺条件为:活性炭的质量浓度25 g/L，时间60 min，温度80℃，pH值为7.0。在此条件下，脱色率为67%，脱蛋白率89%，多糖保留率56%，综合吸附效应指数为68.24%。我国芦笋资源丰富，且其具有较高的营养价值。活性炭法工艺简单、成本低，适合工业化生产的需要，研究其脱色工艺对于芦笋多糖的工业化生产提供可靠的理论依据，确保芦笋保健食品的原料供给充足和高品质。

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