周冉冉，曹茂红

（南通大学附属医院1内分泌科；2神经内科，江苏226001）

叶酸联合维生素B12对糖尿病大鼠记忆能力及Tau蛋白过度磷酸化影响

周冉冉1*，曹茂红2

（南通大学附属医院1内分泌科；2神经内科，江苏226001）

目的：研究糖尿病大鼠脑内各磷酸化位点的变化，探讨叶酸联合维生素B12对糖尿病模型大鼠学习记忆能力及脑内tau蛋白过度磷酸化的影响。方法：糖尿病大鼠用链脲佐菌素腹腔注射制备，实验组予以叶酸联合维生素B12干预。采用Morris水迷宫检测各组大鼠空间记忆及学习能力；用蛋白免疫印迹法观察各组大鼠额叶皮层脑组织总tau、tau部分位点磷酸化变化。结果：（1）Morris水迷宫结果：1型、2型糖尿病组大鼠逃避潜伏期较对照组及单纯药物干预组明显延长（P<0.05），使用叶酸联合维生素B12干预相应模型组后均能显著改善（P<0.05）。（2）叶酸联合维生素B12对糖尿病大鼠脑内tau蛋白过度磷酸化影响：各组大鼠额叶皮层脑组织总tau蛋白含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；1型、2型糖尿病组大鼠额叶皮层脑组织tau蛋白在丝氨酸396/404位点、苏氨酸205位点、苏氨酸212位点的磷酸化水平较对照组及单纯药物干预组明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），使用叶酸联合维生素B12干预后，以上位点磷酸化水平均有明显下降（P<0.05）。结论：糖尿病大鼠脑组织内tau蛋白出现阿尔茨海默病样过度磷酸化；叶酸联合维生素B12干预后可逆转病变，发挥保护脑组织作用。

糖尿病；阿尔茨海默病；Morris水迷宫；tau蛋白；链脲佐菌素；蛋白免疫印迹法；叶酸；维生素B12

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）与糖尿病（diabetes mellitus，DM）密切相关，甚至有学者称阿尔茨海默病为“3型糖尿病”[1]。而痴呆症患者中阿尔茨海默病的比例为50%~75%[2]。近期研究显示胰岛素信号转导通路不仅能有效调节脑内葡萄糖代谢，且还在神经元发育及调节神经元活动方面发挥重要作用，进而影响学习和记忆能力等认知功能[3]。本研究采用糖尿病大鼠模型，模拟人类1型糖尿病及2型糖尿病的损伤机制，记录糖尿病大鼠空间记忆和学习等认知功能状态，研究脑内阿尔茨海默病样改变，同时探讨早期使用叶酸联合维生素B12干预治疗能否预防DM患者罹患AD及其可能的机制，以期临床用于DM患者AD的一级预防。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：健康雄性SD大鼠48只，鼠龄10~12周，南通大学实验动物中心［实验动物生产许可证：SCXK（苏）2008-0010］，清洁级标准。动物饲养在SPF级屏障环境内，温度（22±2）℃，相对湿度40%~70%，噪声＜60dB，工作照度200 lx，动物照度18 lx，昼夜明暗交替时间12h/12h。动物饲喂无菌颗粒饲料（苏州市双狮实验动物饲料科技有限公司）。饮水为自来水瓶装后高压灭菌（脉动真空灭菌器，连云港千樱医疗设备有限公司）。动物自由采食和饮水。实验动物使用许可证：SYXK（苏）2007-0021。动物适应性喂养7天，分别制备1型糖尿病模型和2型糖尿病模型。（2）分组：将实验动物进行随机分组，分为对照组（A组）、叶酸联合维生素B12药物干预组（B组）、1型糖尿病组（C组）、1型糖尿病叶酸联合维生素B12干预组（D组）、2型糖尿病组（E组）、2型糖尿病叶酸及维生素B12干预组（F组）,每组各8只。（3）1型糖尿病模型建立：将C组、D组大鼠过夜禁食12h后，予腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg（STZ，美国Sigma公司，以0.1mol/L柠檬酸缓冲液溶解）。（4）2型糖尿病模型建立：E组、F组先给予高脂饲料，在普通饲料的基础上加入20%的猪油、10%蔗糖、5%蛋黄，喂养5周。过夜禁食12h后，予腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg。（5）1型和2型糖尿病均在注射药物72h后，清晨从尾静脉采血测定血糖。超过16.7mol/L为造模成功，以后1型和2型糖尿病组每周均复测血糖1次，共6周，血糖均超过16.7mol/L者入组。（6）A组仅注射相同剂量柠檬酸缓冲液对照，D组、F组造模成功后每日予叶酸4mg/kg、维生素B12以250μg/kg放入饮用水中饲养6周。B组予与D组、F组相同剂量叶酸联合维生素B12饲养。

1.2 方法 （1）Morris水迷宫行为学测试：保持Morris水迷宫的房间内温度恒定于（26±1）℃，在水迷宫设备的室内墙壁四周张贴不同形状和颜色的图案，以便实验动物识别记忆空间环境。水迷宫为直径160cm，高50cm圆形水池，水深30cm。取池壁圆周4个等距离点设为N、E、S、W即实验起点，分池为4个象限。在池中距池壁一定距离任意一个象限安放一个直径10cm、高29cm的圆形平台。定位航行实验：开始实验前将大鼠放入水中平台适应约15秒，让其熟悉水迷宫环境，试验历时5天，分为上午下午两个时间段，每个时间段训练4次。训练开始时，将大鼠面向池壁从试验起点放入水中。自动记录系统记录到达平台的时间和游泳路径等，4次训练将大鼠从不同起点放入水中。大鼠找到平台或120秒内找不到平台则实验终止，让大鼠在平台上休息30秒后，继续进行下次试验。（2）样品制备：进行Morris水迷宫测试后1周，将大鼠颈椎脱臼断头处死。迅速取出脑组织置于0°C~4°C生理盐水冲洗表面血迹，取100mg新鲜大鼠额叶皮层脑组织，加入1mL脑匀浆缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，8.5%蔗糖，0.1%Triton X-100，2mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1∶10Protease Inhibition cocktail，玻璃匀浆器冰上匀浆。加入1/4体积4×上样缓冲液，沸水浴10min，12，000g离心10 min收集上清液，用改良Lorry法行蛋白含量测定后，置于-80°C低温冰箱中备用。（3）蛋白免疫印迹法：配制10%SDS-PAGE，10%聚丙烯酰胺分离胶及5%聚丙烯酰胺浓缩胶。取出样品，在振荡器上振荡20秒，根据不同抗体要求，在各个泳道加入蛋白，保证每个泳道蛋白总量一致。蛋白电泳分离后采用湿转法将样品转移至PVDF膜，电流350mA，4℃，2h。再将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TBS中室温下封闭2h，加入含有5%脱脂奶粉的TBS配置的一抗，4℃过夜。次日TBS-T漂洗15 min×3次，TBS漂洗15 min×1次，加入用含有5%脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h。最后TBS-T漂洗15 min×3次，TBS漂洗15 min×1次，将膜置于ECL显色液中。临用前A、B液等体积混匀，室温1 min。压片、曝光、显影。

1.3 统计学处理 利用图像分析系统和Quantity One软件，对目的蛋白条带的光密度的实验结果行半定量分析。用GraphPad生化数据处理软件包Prism 5.0进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（χˉ±s）表示，各组间均数比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为学测试：Morris水迷宫定位航行 在5天定位航行实验中，各组大鼠平均逃避潜伏期呈现下降趋势，见表1。对照组、药物干预组大鼠第3天较第2天相比下降明显，差异有统计学意义（P< 0.01）；T1DM组、T2DM组大鼠第3天较第2天相比差异无统计学意义（P>0.05）；T1DM药物干预组大鼠第3天较第2天相比显著下降（P<0.01），T2DM药物干预组大鼠第2天较第1天相比显著下降（P< 0.01）。

实验第3天，T1DM组、T2DM组与正常对照组大鼠相比，其逃避潜伏期明显延长（P<0.05）；T1DM药物干预组、T2DM药物干预组较相应模型组相比显著下降，差异有统计学意义（P<0.01），与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；T1DM组与T2DM组比较差异无统计学意义（P>0.05），如图1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期（±s，n=8）

表1 各组大鼠逃避潜伏期（±s，n=8）

与前1天相比，**P<0.01；与对照组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与相应模型组相比，＃＃P<0.01

组别 第1天（S） 第2天（S） 第3天（S） 第4天（S） 第5天（S）对照组 104.90±5.16 97.73±7.13 61.70±7.93**51.03±7.88 38.82±7.38药物干预组 94.83±6.38 76.41±7.22 48.75±8.09**32.89±6.69 29.48±6.39 T1DM组 112.03±4.13 110.40±4.05 94.47±7.05△△87.29±8.10 70.00±7.49 T1DM药物干预组 98.35±5.39 84.18±8.44 53.67±7.79**＃＃28.15±5.23 24.47±4.92 T2DM组 102.79±6.10 92.79±7.48 85.72±7.46△69.58±8.29 64.92±8.95 T2DM药物干预组 105.49±5.77 73.40±8.08**57.13±7.88＃＃43.32±7.88 35.55±6.92

图1 各组大鼠定位航行第3天逃避潜伏期

2.2 蛋白免疫印迹：叶酸联合维生素B12对糖尿病大鼠脑内tau异常过度磷酸化的影响 各组大鼠额叶皮层脑组织总tau蛋白含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。T1DM组、T2DM组大鼠额叶皮层脑组织tau蛋白丝氨酸396/404位点、苏氨酸205位点、苏氨酸212位点的磷酸化水平较对照组及单纯药物干预组明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；使用叶酸联合维生素B12干预后，T1DM药物干预组、T2DM药物干预组大鼠在各位点磷酸化水平均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；T1DM组与T2DM组比较差异无统计学意义（P>0.05），如图2。

3 讨 论

AD与DM相关性的机制目前尚不十分清楚，可能与脑内蛋白非酶糖基化、神经递质异常、tau蛋白异常过度磷酸化、脑细胞凋亡及氧化应激等相关。研究显示外周胰岛素水平绝对或者相对不足，可导致磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）途径抑制[4]。其下游物质GSK-3β由非活性转变为活性形式，使tau蛋白易发生阿尔茨海默病样病变[5]。此外研究显示胰岛素异常还可影响同型半胱氨酸的分解代谢，导致糖尿病合并症患者血浆中同型半胱氨酸水平明显升高。而同型半胱氨酸与叶酸水平呈负相关，提示胰岛素抵抗是影响同型半胱氨酸的重要因素[6]。同型半胱氨酸依赖于叶酸、维生素B12，参与甲基化合成蛋氨酸。异常蛋氨酸循环产物可导致PP2A的甲基化降低，使其对tau蛋白去磷酸化作用降低，也易发生阿尔茨海默病样病变。因此，本实验选取叶酸联合维生素B12干预糖尿病大鼠来加以验证。

图2 各位点tau蛋白磷酸化水平的变化

神经纤维缠结（NFTs）是阿尔茨海默病的特征性损害。在神经纤维缠结的tau中，已有超过40个磷酸化位点被证实[7]，很多研究致力于蛋白激酶及蛋白磷酸酶调节tau蛋白的磷酸化。体外研究发现在某些位点许多蛋白激酶能磷酸化tau蛋白，许多蛋白磷酸酶去磷酸化tau蛋白。然而蛋白激酶和磷酸酶如何调节tau的磷酸化还没有研究充分。目前研究发现，GSK-3β、cdk5、PKAA、CaMK-Ⅱ是最重要的激酶。而在所有经典的磷酸化丝氨酸/磷酸化苏氨酸蛋白磷酸酶中，PP2A在脑内最为重要[8]。在30多个磷酸化位点中,GSK-3β及PP2Ac分别与特异的位点相对应[9]。

本实验采用糖尿病模型，Morris水迷宫显示糖尿病组大鼠逃避潜伏期明显延长，说明糖尿病使学习记忆能力下降。予以叶酸联合维生素B12干预后，逃避潜伏期下降，说明其能在一定程度上改善糖尿病大鼠的认知功能。此外本实验选取了最常见的Ser205、Thr 212、Ser396、Ser404位点，旨在分子水平上观察糖尿病大鼠发生阿尔茨海默样改变的机制。实验发现1型、2型糖尿病模型脑内磷酸化水平均显著增加。经叶酸联合维生素B12药物干预后，Ser205、Thr 212、Ser396/404位点的磷酸化水平显著改善，说明其在一定程度上有逆转阿尔茨海默样改变的作用。但发生脑内tau磷酸化的改变及改善的机制，我们拟通过GSK-3β、PP2Ac等特异位点进一步实验去探讨。

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[2]Van Mierlo LD，Meiland FJ，Van Der Roest HG，et al.Personalised caregiver support：effectiveness of psychosocial interventions in subgroups of caregivers of People with dementia［J］.Int J Geriatr Psychiatry，2012，27（1）：1-14.

[3]GerozissisK.Brain insulin，energy and glucose homeostasis; genes,environment and metabolic pathologies［J］.Eur J Pharmacol，2008，585（1）：38-49.

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[5]Zhang Z，Zhao R，Qi J，et al.Inhibition of glycogen synthase kinase-3β by Angelica sinensis extract decreases β-amyloid-induced neurotoxicity and tau phosphorylation in cultured cortical neurons［J］.J Neurosci Res，2011，89（3）：437-447.

[6]HofmannMA，Kohl B，Zumbach MS，et al.Hyperhomocyst（e）inemia and endothelial dysfunction in IDDM［J］.Diabetes Care，1997，20（12）：1880-1886.

[7]Wang JZ，Liu F.Microtubule-associated protein tau in development，degeneration and protection of neurons［J］.Prog Neurobiol，2008，85（2）：148-175.

[8]Iqbal K，Liu F，Gong CX，et al.Mechanisms of tau-induced neurodegeneration［J］.Acta Neuropathol，2009，118（1）：53-69.

[9]Wang JZ，Grundke-Iqbal I，Iqbal K.Kinases and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofibrillary degeneration［J］.Eur J Neurosci，2007，25（1）：59-68.

Supplementation of folic acid and vitamin B12prevents the performance in Morris water maze and Alzheimer-like hyperphosphorylation of tau in diabetes mellitus rats

ZHOU Ranran1,CAO Maohong2
(1Department of Endocrinology,Affiliated Hospital of Nantong University;2Department of Neurology,Affiliated Hospital of Nantong University Nantong,Jiangsu 226001)

Objective:To investigate the changes of hyperphosphorylation of tau in the brain of diabetes mellitus model rats and to determine whether the supplementation of folic acid and vitamin B12prevents the AD-like hyperphosphorylation of tau in the diabetes rat brain and leaning and memory deficits,which may provide a theory reference for the clinical application.Methods:Diabetes mellitus rats were induced by intraperitoneal injection Streptozocin,and the treatment groups were treated with folic acid/vitamineB12.The spatial memory and learning ability was tested by the Morris water maze.Western blot was used to detect the level of some proteins such as total tau and phosphorylation of tau at some sites.Results:(1)Results of Morris water maze:both type I diabetes mellitus(T1DM)and type II diabetes mellitus(T2DM)rats had much longer escape latency(P<0.05),and the time of escape latency was significantly shortened in the diabetes rats which received the supplementation of folic acid and vitamin B12(P<0.05).(2)Effect of supplementation of folic acid and vitamin B12on the abnormal hyperphosphorylation of tau in diabetes mellitus rats:the level of tau in the frontal cortex of brain had no difference(P>0.05);the levels of phosphorylated tau at serine 396/404,threonine 205 and threonine 212 were increased in both T1DM group and T2DM group(P<0.05),suggesting the hypeprhosphorylation of tau in diabetes rat brain.Supplementation of folic acid and vitamin B12attenuated hyperphosphorylation significantly at the above sites(P<0.05).Conclusion:It was showed in the test that the spatial memory and learning ability of T1DM group and T2DM rats was impaired significantly,and Tau in the brain of DM model rats was hyperphosphorylated.Both of them were improved by supplementation of folic acid and vitamin B12.

Alzheimer’s disease；diabetes mellitus；Morris water maze；tau；folic acid；vitamin B12

R587.1

A

2014-10-13

1006-2440（2014）06-0586-04

周冉冉，女，汉族，江苏通州人，生于1984年11月，硕士，住院医生。研究方向：糖尿病的神经系统病变。