杨 力，王信峰，姜胜华，尤学芬，蔡奕峰，刘 红

（南通大学附属医院血液科，江苏226001）

淋巴细胞白血病和淋巴瘤T细胞受体基因重排研究

杨 力*，王信峰，姜胜华，尤学芬，蔡奕峰，刘 红

（南通大学附属医院血液科，江苏226001）

目的：探讨淋巴细胞白血病及淋巴瘤的T淋巴细胞受体（TCR）Vβ亚家族分布特点。方法：用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测急性淋巴细胞白血病5例，慢性淋巴细胞白血病2例，弥漫大B淋巴瘤3例及外周T淋巴瘤3例患者的外周血或淋巴结T淋巴细胞TCR Vβ亚家族表达。对照组为健康人8例。结果：对照组健康8例外周血淋巴细胞表达全部24个Vβ亚家族。急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病患者外周血淋巴细胞TCR Vβ亚家族均呈限制性表达，外周T淋巴瘤2例和弥漫大B淋巴瘤1例Vβ亚家族呈限制性表达，另外3例表达未受抑制。而淋巴瘤患者淋巴结标本Vβ亚家族全部呈限制性表达。结论：TCR基因重排对淋巴瘤和淋巴细胞白血病的诊断有辅助作用。

急性淋巴细胞白血病；淋巴瘤；T细胞受体重排；逆转录聚合酶链反应

在正常淋巴细胞发育过程中，T细胞受体（TCR）经过多次基因重排，表现为多克隆性。而淋巴细胞白血病或淋巴瘤等淋巴系统肿瘤，TCR基因重排则在某一阶段发生克隆性增生[1]。利用PCR等技术检测TCR基因重排，对于协助诊断和监测微小残留病灶有重要意义。我院2011年—2013年6月收治初诊淋巴系统恶性肿瘤患者13例，本研究分析其TCR Vβ亚家族分布及克隆性增生的特点，并探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 淋巴系统恶性肿瘤患者13例，其中急性淋巴细胞白血病5例（B细胞3例，T细胞2例），慢性淋巴细胞白血病2例，弥漫大B细胞淋巴瘤3例，外周T淋巴瘤3例。白血病患者标本取自外周血，淋巴瘤患者标本取自细针穿刺淋巴结和外周血。对照组为健康人8例。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器：RNA提取用Trizol（上海生工生物工程公司）；cDNA第一链合成试剂盒和PCR扩增用Taq酶（晶美生物工程有限公司）；梯度PCR扩增仪（美国Touchgene公司）。

1.2.2 RNA提取和cDNA合成：用PBS反复冲洗吸有淋巴瘤标本的穿刺针，离心弃上清，加入RP－MI1640细胞培养液调整细胞浓度1×106/mL，Trizol法提取细胞总RNA。cDNA第一链合成：加入总RNA 5μg，70℃水浴5 min，冰浴30 s。加入反应缓冲液、RNase inhibitor和dNTP mix，37℃孵浴5 min。加入逆转录酶RevertAidTM M-Mulv（200U/μL）1μL，42℃水浴60 min，70℃水浴10 min。患者和健康人外周血分离单个核细胞，按同样方法调整细胞浓度1× 106/mL，提取细胞总RNA，合成cDNA第1链。

1.2.3 PCR扩增：按文献设计[2]TCR Vβ亚家族上游引物，β链恒定区共用下游引物（上海生工生物工程公司）。取DEPC处理过0.5 mL微量EP管，依次加入下列试剂：第1链 cDNA 2μL，上下游引物（10pmol/μL）各 2 μL，dNTP mix（10 mmol/L）0.8 μL，10×Taq buffer 5 μL，Taq酶（25u/μL）0.5 μL，MgCl2（25mmol/L）3 μL。加入适量dd H2O，使总体积达50μL，轻轻混匀后离心。PCR条件：94℃预变性3min，94℃变性 1min、55℃退火 1min、72℃延伸1min、35个循环，最后延伸72℃10min。

1.2.4 电泳：在PCR产物中加入溴酚蓝上样缓冲液5 μL，混匀，取10μL加样。与DNA marker一起，在含溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶上电泳分离，电压100V，电流60mA。30min后将凝胶置于四星图像分析仪中摄像。

2 结 果

对照组8例外周血淋巴细胞表达全部24个Vβ亚家族。急性淋巴细胞白血病5例和慢性淋巴细胞白血病2例患者外周血淋巴细胞Vβ亚家族呈限制性表达，多数亚家族表达受到抑制。淋巴瘤患者淋巴结标本Vβ亚家族呈限制性表达。外周T淋巴瘤2例和弥漫大B淋巴瘤1例患者外周血淋巴细胞Vβ亚家族表达受限制，其余淋巴瘤病例表达全部24个Vβ亚家族。结果见表1，其中4例如图1~4。

表1 TCR Vβ亚家族表达

图1 急性淋巴细胞白血病表达TCR Vβ1，3，13亚家族

图2 慢性淋巴细胞白血病表达TCR Vβ3，5，9，10亚家族

图3 弥漫大B淋巴瘤表达TCR Vβ6，13亚家族

图4 外周T淋巴瘤表达TCR Vβ7，11，13亚家族

3 讨 论

正常人的T淋巴细胞TCR基因重排是完全随机的，因而外周血淋巴细胞表达全部24个Vβ亚家族。而T淋巴细胞肿瘤的肿瘤组织中T淋巴细胞是单克隆的[3]，其中包括肿瘤T淋巴细胞，也包括肿瘤抗原诱导的T克隆淋巴细胞，甚至外周血中T细胞也受影响。这些克隆性T细胞抑制其它正常克隆T细胞正常表达，因而T细胞淋巴瘤TCR基因Vβ亚家族存在谱系偏移，呈限制性表达。研究发现，外周T细胞淋巴瘤和T细胞急性淋巴细胞白血病TCR Vβ亚家族呈限制性表达。

整个过程可能与T细胞CDR3区序列有关，其空间结构决定TCR的特异性，在抗原识别中起关键作用。CDR3区域在某些抗原反复刺激下，激活原癌基因使T细胞进行克隆性增生，发展为肿瘤性T细胞。或者对肿瘤相关抗原决定簇进行特异性识别，引起克隆性T细胞增生[4]。

同样在B细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病中，其CDR3区域对肿瘤B细胞相关抗原决定簇进行特异性识别。引起克隆性T细胞增生，进而抑制其它亚家族T细胞增生。因此TCR基因Vβ亚家族也存在谱系偏移[5]，呈限制性表达。研究支持急性淋巴细胞白血病中的B细胞、慢性淋巴细胞白血病和弥漫大B淋巴瘤TCR基因Vβ亚家族表达受抑制。

3例淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中，表达全部24个Vβ亚家族，其中外周T淋巴瘤性1例，弥漫大B淋巴瘤2例。这是由于外周血中的T淋巴细胞，除了肿瘤T淋巴细胞和肿瘤抗原诱导的T克隆淋巴细胞，也存在对外来抗原的干扰。因此淋巴瘤患者尽量选择肿瘤组织的标本。

综上所述，研究表明TCR基因重排，对淋巴瘤和淋巴细胞白血病的诊断有辅助作用。由于病例较少，TCR基因重排对于疾病的进展和进展预后[6]，以及诊断的特异性和敏感性，还有待进一步研究。

[1]Bas A，Hamm arstrom SG，Hammarström ML.Extrathymic TCR gene rearrangement in human small intestine:identification of new splice forms of recombination activating gene-1 mRNA with selective tissue expression［J］.Journal of Immunology，2003，171（7）：3359-3371.

[2]Yao XS，Zhang GW，Ma L，et al.Analysis of the CDR3 length of TCR alphabeta T cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatol Res，2006，35 （1）：10-18.

[3]Assaf C，Hummel M，Dippel E，et al.High detection rate of T-cell receptor beta chain rearrangements in T-cell lymphoproliferations by family specific polymerase chain reaction in combination with the GeneScan technique and DNA sequencing［J］.Blood，2000，96（2）：640-646.

[4]张建波，宋永平，于庆凯，等.B细胞非霍奇金淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析［J］.白血病·淋巴瘤，2009，18 （9）：556-558.

[5]Echchakir H，Dorothée G，Vergnon I，et al.Cytotoxic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen display similar HLA tetramer binding but distinct functional avidity and tissue distribution［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（14）：9358-9363.

[6]Assaf C，Hummel M，Dippel E，et al.High detection rate of T-cell receptor beta chain rearrangements in T-cell lymphoproliferations by family specific polymerase chain reaction in combination with the GeneScan technique and DNA sequencing［J］.Blood，2000，96（2）：640-646.

Study of TCR gene rearrangement in acute lymphoblastic leukemia and lymphoma

YANG Li,WANG Xinfeng,JIANG Shenghua,YOU Xuefen,CAI Yifeng,LIU Hong
（Department of Hematology,Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu 226001）

Objective:To investigate the distribution characteristics of T lymphocyte T cell receptor(TCR)Vβ subfamily in acute lymphoblastic leukemia and lymphoma.Methods:The expression of TCR Vβ subfamilies in peripheral blood or lymph nodes was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)among acute lymphoblastic leukemia(5 cases)and lymphoma patients(2 cases of chronic lymphocytic leukemia,3 cases of diffuse large B lymphoma,3 cases of peripheral T lymphoma).Results:The expression of TCR Vβ subfamilies was restricted in peripheral blood among acute lymphoblastic leukemia,chronic lymphocytic leukemia and three cases of lymphoma patients.However, the other three cases were not inhibited.The expression of Vβ subfamilies in lymph nodes specimens was all restricted.Conclusion:Detecting TCR gene rearrangements plays a supplementary role in the diagnosis of lymphoma or lymphoblastic leukemia.

acute lymphoblastic leukemia；lymphoma；lymphocyte T cell receptor rearrangements；reverse transcription polymerase chain reaction

R733.7

A

2014-09-15

1006-2440（2014）06-0599-03

杨力，男，汉族，江苏东台人，生于1975年10月，博士在读，副主任医师。研究方向：淋巴瘤和出血血栓疾病。