张 翔，杜旭东，周 昱，刘益飞

（1无锡市第二人民医院普外科，江苏214000；2南通大学附属医院病理科）

结肠直肠癌中FOXO4的表达与临床病理关系

张 翔1，杜旭东1，周 昱1，刘益飞2

（1无锡市第二人民医院普外科，江苏214000；2南通大学附属医院病理科）

目的：研究叉头样转录因子O4（FOXO4）在结肠直肠癌患者组织中的表达情况，并探讨FOXO4转录因子与结肠直肠癌发病间联系及临床意义。方法：选取结肠直肠癌102例患者手术切除肿瘤及其癌旁正常组织，应用免疫组织化学染色法检测FOXO4表达情况，并进一步分析其与患者临床病理参数的关系。结果：在CRC102例肿瘤组织中FOXO4阳性56例（54.9%），显著低于FOXO4在癌旁组织中的表达91例（89.2%），两者比较差异有统计学意义（χ2=27.335，P<0.05）。肿瘤组织中FOXO4表达水平在患者年龄、性别，肿瘤大小和浸润深度间差异无统计学意义（P> 0.05）；但在肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：FOXO4转录因子可能既是一种细胞增殖的负性调节因子，亦是一种细胞凋亡促进因子，参与肿瘤的发生、分化及转移，发挥肿瘤抑制因子的作用。

结肠直肠癌；叉头样转录因子；免疫组织化学SP法

结肠直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和病死率仅次于胃癌、原发性肝癌和食管鳞癌。随着分子生物学的发展，对直肠癌的生物学特性，尤其是分子水平上的差异有了更加本质的认识。CRC的发生可能涉及肠粘膜上皮细胞的过度增殖、凋亡受阻、分化障碍等。FOXO4转录因子是 FOXO（forkhead transcription factor O family，FoxO）亚家族中的一员，因其参与调控细胞增殖、凋亡、分化等过程，而在肿瘤发病机制的研究中日益受到重视。选取南通大学附属医院病理科2006年1月-2008年1月外科手术切除CRC 102例肿瘤组织和相对应的癌旁组织标本，分析FOXO4蛋白在结肠直肠组织中的差异表达。

1 资料与方法

1.1 一般资料 结肠直肠癌102例，男57例，女45例；年龄25~75岁，平均50.24±10.52岁，其中≤60 岁49例，＞60岁53例。肿瘤大小：最大径≤3cm 50例，最大径＞3cm 52例；分化程度:高中分化腺癌87例，低分化腺癌15例；浸润浆膜及浆膜以外者76例，未及浆膜者26例；伴有肠周淋巴结转移57例，无肠周淋巴结转移45例。按照世界卫生组织2004年版《消化系统肿瘤病理学和遗传学》标准对CRC进行TNM分期:其中I~II期54例，III~IV期共48例。患者术前均未经放疗、化疗或免疫治疗。

1.2 方法 （1）病理标本制作：CRC肿瘤组织和相对应的癌旁组织标本，均经术后临床病理诊断证实。所有病理标本经4%中性甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，制备4μm厚连续切片。（2）免疫组化SP法：FOXO4蛋白染色方法按试剂盒说明书步骤进行，均为4℃过夜，经DAB显色。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。（3）结果判定：每张切片随机观察10个具有代表性的高倍视野，依照染色程度及染色细胞数进行综合分析评分：按细胞显色深浅记分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。按着色细胞占计数细胞百分率评分：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞数小于10%，2分为11%～50%，3分为51%～80%，4分为大于80%，两者相乘0～2分为（-），3～4分为I级，6～8分为II级，9～12分为III级，I、II、III级均为阳性。

1.3 统计学处理 运用SPSS16.0统计软件进行分析，率比较采用χ2检验，相关性分析用Spearman等级相关检验。P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FOXO4在CRC肿瘤组织和癌旁肠粘膜组织中表达 FOXO4阳性染色主要定位于腺上皮细胞细胞核，呈棕黄色。在CRC高中分化腺癌中，着色深浅不一，呈颗粒状、点状或者散在分布（图1），而低分化腺癌表达较少（图2）。在102例肿瘤组织中FOXO4阳性56例（54.9%），FOXO4在癌旁组织中阳性91例（89.2%），两者比较差异有统计学意义（χ2= 27.335，P<0.05）。

图1 FOXO4高中分化腺癌中高表达（200×）

图2 FOXO4低分化腺癌中低表达（200×）

2.2 肠癌组织中FOXO4蛋白表达与临床病理学特征关系 FOXO4在CRC肿瘤组织中的表达率与患者的性别、年龄，肿瘤大小和浸润深度无相关性（P> 0.05），而与CRC肿瘤组织分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P<0.05），见表1。高-中分化组显著高于低分化组；无淋巴结转移组显著高于有淋巴结转移组；TNM分期（I~II期组显著高于III~IV期）。

表1 CRC癌组织中FOXO4蛋白表达与临床病理特征的关系

3 讨 论

FOXO属于Fox（Forkhead box）叉头盒蛋白家族的一个亚族，从蠕虫到人均有表达。作为一类新的转录调节因子，由于其在机体内的重要生物作用，已迅速成为近期科学研究的热点。哺乳动物细胞中的FOXO蛋白亚族由4个截然不同的基因编码组成：FOXO1（FKHR），FOXO3（FKHRL1），FOXO4（Afx），FOXO6。通过调节靶基因表达对机体细胞增殖、细胞周期阻滞、压力耐受性、DNA损伤修复、氧化应激反应、细胞分化、细胞凋亡控制等发挥极为重要的调控作用[1]。同时FOXO在胸腺细胞、外周血T淋巴细胞、淋巴结和脾脏中均可表达，提示可能在机体免疫系统的发育及免疫功能调节方面有重要作用[2-3]。FOXO家族成员在哺乳动物的不同组织中以不同的水平表达，研究发现在胃肠道表达的最主要为FOXO4[4]，受上游PI3K—Akt/PKB介导磷酸化级联通路的负调控。乙酞化修饰也是FOXO转录因子可逆调节的重要方式之一。同磷酸化一样，CREB蛋白结合酶是乙酞化修饰的主要酶，它结合FOXO蛋白通过乙酰化过程，从细胞核内输出至细胞质，使其转录活性消失，脱乙酞化后FOXO蛋白又能重新恢复其转录活性[5]。FOXO转录因子还受泛素蛋白酶体系统的调节。细胞在氧化应激因子刺激下，通过泛素-蛋白酶体通路，诱导FOXO蛋白泛素化，引起FOXO蛋白分解，使其生物功能消失，触发其重新定位到细胞核内，同时在细胞的应激适应性反应下，使转录活性增强。这一泛素化修饰过程也是可逆的，脱泛素化后，FOXO蛋白可恢复其转录活性[6-7]。研究报道，F0X04在多种肿瘤的发生发展中同样发挥抑制肿瘤的作用。Yang等[8]研究发现癌基因HER2在裸鼠体内过表达可诱导肿瘤形成，并使得HER2介导的p27在胞浆中的错误定位发生逆转，进而缩小肿瘤模型的体积，抑制肿瘤进展。Tang等[9]研究证实，FOXO4能够下调HIF-1 alpha蛋白表达水平。HIF-1 alpha是氧平衡的关键调节因子，其表达增加能够诱导血管生成，红细胞生成，糖代谢相关基因的表达，而这些都是肿瘤生长不可或缺的条件。

此外，FOXO蛋白还可通过上调Bcl-2家族的Bim调亡蛋白的表达诱导肿瘤细胞、造血干细胞及内皮细胞调亡。FOXO4能够增强转录抑制因子Bel-6的表达，抑制其基因表达而促进细胞调亡[10]。Lee 等[11]发现FOXO4与XA8在生长因子介导的胆管上皮癌在EMT改变期间的肿瘤进展和转移中有重要作用，提示FOXO4有可能参与肿瘤转移过程。以上研究说明FOXO转录因子可能既是一种细胞增殖的负性调节因子，亦是一种细胞调亡促进因子。

本研究中，我们用免疫组织化学方法分析FOXO4蛋白在结肠直肠组织中的差异表达。癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁组织，差异具有统计学意义。本研究发现FOXO4的表达缺失与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关。提示FOXO4在CRC发生过程中，起着肿瘤抑制因子的作用，并可能参与肿瘤细胞的分化调控以及转移，与以往研究结果一致[12]。因此可以认为FOXO4的表达缺失与CRC的发生发展密切相关。

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Expression and clinical significance of FOXO4 in colorectal cancer

ZHANG Xiang1,DU Xudong1,ZHOU Yu1,LIU Yifei2
（1Departmnet of General Surgery，the Second Hospital of Wuxi，Jiangsu 214000;2Departmnet of Pathology，the Affiliated Hospital of Nantong University）

Objective:To investigate the expression and clinical significance of forkhead transcription factor O4 （FOXO4）in colorectal cancer tissues.Methods:Immunohistochemical staining was used to detect the FOXO4 expression in 80 cases of colorectal cancerand adjacent normal tissue，and to analyze the relationship with clinical pathology parameters.Results:The positive expression rate of FOXO4 in colorectal cancer tissues was 54.9%（56/102），which was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer89.2%（91/102）（P<0.05）.Statistical analysis showed that for the FOXO4 expression there was no significant difference in the patients’age，gender，tumor size and invasion depth （P>0.05）;howerver,there wre significant differences of expression in tumor differentiation，TNM stage and lymph node metastasis（P<0.05）.Conclusion:FOXO4 transcription factor may be a negative regulator of cell proliferation，and is also a kind of cell apoptosis promoting factor.FOXO4 may function as a tumor suppressor in tumorigenesis，development，differentiation and metastasis.

colorectal cancer;forkhead transcription factor O4（FOXO4）;immunohistochemical staining

R735.3+5

A

2014-09-12

1006-2440（2014）06-0596-04

张翔，男，汉族，江苏泰州人，生于1981年12月，本科，主治医师，研究方向：胃肠肿瘤的发病机制和治疗。 通信作者：刘益飞，

E-mail：bluefiime@qq.com