马 进，高宜录，沈剑虹

（1昆山市第一人民医院神经外科，江苏215300；2南通大学附属医院神经外科）

磷酸甘油酸变位酶1在脑胶质瘤中的表达及意义

马 进1*，高宜录2，沈剑虹2

（1昆山市第一人民医院神经外科，江苏215300；2南通大学附属医院神经外科）

目的：研究磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）在脑胶质瘤细胞中的表达情况，探讨PGAM1在胶质瘤恶性生长中的作用。方法：应用逆转录聚合酶链反应检测PGAM1在大鼠C6胶质瘤细胞和星形胶质细胞中的表达。应用免疫组织化学法检测人脑胶质瘤组织和瘤周脑组织中PGAM1蛋白的表达。结果：（1）PGAM1在C6胶质瘤细胞中表达显著高于星形胶质细胞（P<0.05）。（2）对照组15例瘤周脑组织中PGAM1阴性12例，阳性表达3例（20.00%）。观察组43例脑胶质瘤标本中PGAM1阳性表达29例，PGAM1阴性14例（67.44%）。PGAM1两组表达率比较差异有统计学意义（χ2＝8.29，P<0.05）。结论：PGAM1可能与人脑胶质瘤的恶性生长有关。

脑胶质瘤；磷酸甘油酸变位酶1；糖酵解；逆转录聚合酶链反应；免疫组织化学法

大多数正常组织通过糖的有氧分解获取能量，只有在缺氧时才进行无氧糖酵解。肿瘤组织即使在氧供充分的条件下也主要以无氧糖酵解获取能量，这与瘤细胞线粒体的功能障碍、瘤细胞的酶谱变化，特别是糖酵解酶活性增加和同工酶谱的改变有关。我们对星形细胞来源的C6胶质瘤细胞，和体外纯化培养的大鼠皮层星形胶质细胞进行蛋白组学研究[1]，发现包括磷酸甘油酸变位酶1（phosphoglycerate mutase 1，PGAM1）在内的多个糖酵解相关酶在C6细胞中表达增高。本研究用RT-PCR法，检测PGAM1 在C6细胞和大鼠星形胶质细胞中的表达差异，并用免疫组织化学法检测PGAM1在人脑胶质瘤和瘤周脑组织的表达情况，探讨PGAM1在脑胶质瘤恶性生长中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床标本 收集南通大学附属医院神经外科2012年1月—12月手术的脑胶质瘤43例，其中男18例，女25例，年龄28～66岁，平均47岁。根据2000年WHO神经系统肿瘤分级标准进行病理分级，其中Ⅰ级3例，Ⅱ级15例，Ⅲ级17例，Ⅳ级8例。所有切片均经2名以上有经验的病理科医师共同确诊。对照组为手术暴露肿瘤所必须切除的瘤周脑组织15例，并经HE染色证实为正常脑组织。所有病例术前均未接受放化疗。

1.2 材料与试剂 7天新生SD大鼠（南通大学实验动物中心）；C6胶质瘤细胞株（中科院上海细胞所）。DMEM，F12（GIBCO）；Trizol（Invitrogen）；RT-PCR kit，dNTP，Taq DNA聚合酶（Promega）；SP法免疫组化超敏试剂盒，羊抗人PGAM1抗体，DAB染色剂（上海晶美生物技术有限公司）；兔抗大鼠GFAP多克隆抗体（Sigma），FITC-羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程公司）；PGAM1及β-actin引物序列用Primer Premier 5.0设计，行BLAST排除同源性，由上海英骏生物技术公司合成。

1.3 方法

1.3.1 星形胶质细胞培养传代：无菌条件下取生后7天的SD大鼠大脑皮层组织，于4℃Hanks液中洗涤两遍。将组织剪成<1mm×1mm碎块，用0.125%的胰蛋白酶液37℃消化20min。加入少许含15%小牛血清的DMEM培养液并吹打以终止消化，4℃1 000 r/min离心5min后弃去上清液。加入含15%小牛血清的DMEM/F12培养液，轻轻吹打，制成初细胞悬液。并将其接种至培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中静置40min。吸出未贴壁的细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤。将滤液于4℃1 000r/min离心10min后弃上清，加入含15%小牛血清的DMEM/F12培养液，制成次细胞悬液，按1×104个/cm2接种于预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中。培养10天左右，培养液微黄时半量换液。细胞基本铺满瓶底时用0.125%的胰蛋白酶消化传代，按5×104个/cm2接种。1.3.2 星形胶质细胞的鉴定：细胞按5×104个/cm2接种于24孔培养板中预先包被多聚赖氨酸的盖玻片上，常规培养2天。4%多聚甲醛固定后行免疫细胞化学检测，一抗为兔抗大鼠GFAP多克隆抗体，二抗为FITC-羊抗兔IgG，Hoechst 33342染核。

1.3.3 C6胶质瘤细胞培养与传代：C6细胞用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液，培养4～6天，隔日半量换液1次。约3天传代1次，接种密度5×104个/cm2。

1.3.4 RT-PCR检测：待行RT-PCR检测细胞培养于6孔板上，C6和星型胶质细胞各3孔，每孔行1 次RT和3次PCR检测。于细胞基本铺满培养板时用Trizol提取C6和星型胶质细胞总RNA。

Pgam1引物序列：Pgam1-F：5’-CCT CCT GTG AGA GCC TGA AG-3’（nt452-nt471）；Pgam1-R：5’-CTT CTT CAC CTT GCC CTG AG-3’（nt762-nt743），长度311bp。

内参采用 β-actin：β-actin-F：5’-CAT CTA TGA GGG TTA CGC G-3’（nt573-nt591），

β-actin-R：5’-GAA GGT GGA CAG TGA GGC-3’（nt1137-nt1120），长度565bp。

PCR预变性94°C 7min;变性94°C 30sec，复性56°C 30sec，延伸72°C 30sec;延伸72°C 10min。反应结束，扩增DNA电泳鉴定，同时使用图像分析仪进行条带半定量分析。

1.3.5 免疫组织化学检测：一抗为羊抗人PGAM1抗体，DAB液显色。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。免疫组化结果判定：胞浆出现棕黄色颗粒为PGAM1阳性，用瘤周脑组织切片做阴性对照。根据染色强度分为阴性（棕黄色反应细胞<10%）、弱阳性（棕黄色反应细胞数>10%，但<70%）、强阳性（棕黄色反应细胞>70%）。弱阳性、强阳性均以阳性统计。

1.4 统计学处理 应用SPSS 14.0统计学软件，对星形胶质细胞与C6胶质瘤细胞相应RT-PCR电泳条带相对吸光度值进行t检验，对人脑胶质瘤组织标本和瘤周脑组织免疫组化结果采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 星形细胞纯度鉴定结果 Hoechst 33342染色后所有细胞核发出蓝色荧光。经免疫荧光染色显示，GFAP表达于90%以上细胞的胞体和突起，呈绿色荧光，说明纯化培养后星形胶质细胞有很高的纯度。2.2 逆转录聚合酶链反应检测结果 星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞均可见PGAM1 mRNA表达（图1A），C6胶质瘤细胞组表达显著高于星形胶质细胞组（P<0.05），见图1B。2.3 免疫组织化学法检测结果 在对照组15例瘤周脑组织中PGAM1阴性12例，阳性表达3例（20.00%）。观察组43例脑胶质瘤组织标本中, PGAM1阳性表达 29例，PGAM1阴性 14例(67.44%)。PGAM1在胶质瘤和在瘤周脑组织的表达率比较差异有统计学意义（χ2＝8.29，P<0.05）。

图1 A RT-PCR检测PGAM1 mRNA表达图1B PCR产物半定量分析

3 讨 论

1931年Warburg等[2]发现，肿瘤细胞优先利用糖酵解的能量来满足自己的需要。即肿瘤细胞获得ATP的方式发生明显改变，即使氧气供应充足，有氧氧化也会减弱，而糖酵解则增强（Warburg效应）。肿瘤细胞糖酵解增强的主要原因与肿瘤细胞酵解酶的活性增强有关。抑制糖酵解酶的策略在近年体内外实验研究中，取得了明显的抗癌效果。通过调控糖酵解上游机制来抑制肿瘤细胞的能量代谢，则是另一种治疗策略[3-4]。国外研究表明，抑制糖酵解的某些酶能有效杀灭肝癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病等恶性肿瘤细胞及其化疗耐药株[5-7]。

在我们的前期研究中[1]，利用蛋白质组学方法，对C6胶质瘤细胞和体外培养纯化的大鼠星形胶质细胞蛋白进行双向凝胶电泳分析。结果发现17个蛋白在胶质瘤中表达明显异常，包括代谢相关、细胞骨架、生物转化和信号转导因子等。其中代谢相关蛋白中前5个蛋白分别为：磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶（PGAM1）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，任何1个酶都是参与无氧酵解过程的关键酶。

本次研究发现，与大鼠和人的正常星形胶质细胞对照，无论是人胶质瘤细胞还是体外培养的大鼠C6细胞，PGAM1的表达都明显增加。PGAM1作为糖酵解途径的重要酶之一，主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸，最终成为磷酸烯醇式丙酮酸。近年很多研究表明，PGAM1与肿瘤代谢[8-9]、肿瘤转移[10]、肿瘤预后[11－12]关系密切。Evens等[13]研究认为，肿瘤细胞生存有赖于糖酵解途径，PGAM1可作为肿瘤治疗的新靶点。本次结果验证了我们前期的研究结果，因而推测PGAM1在胶质瘤的恶性生长也中起了一定作用。

[1]高宜录，刘鹏，孙华林，等.大鼠星形胶质细胞与C6胶质瘤细胞的蛋白质组学分析［J］.中华医学杂志，2007，87 （48）：3421-3424.

[2]Warburg O.On respiratory impairment in cancer cells［J］. Science，1956，124（3215）：269-270.

[3]曹垒，王颖毅，王希瑞，等.RAS蛋白在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生长的影响［J］.中华医学遗传学杂志，2012，29（2）：159-162.

[4]Ren F，Wu H，Lei Y，et al.Quantitative proteomics identification of phosphoglycerate mutase 1 as a novel therapeutic target in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Cancer，2010，9：81.

[5]Ko YH，Pedersen PL，Geschwind JF.Glucose catabolism in the rabbit VX2 tumor model for liver cancer:characterization and targeting hexokinase［J］.Cancer Lett，2001，173（1）：83-91.

[6]Xu RH，Pelicano H，Zhou Y，et al.Inhibition of glycolysis in cancer cells:a novel strategy to overcome drug resistance associated with mitochondrial respiratory defect and hypoxia ［J］.Cancer Res，2005，65（2）：613-621.

[7]Gwak GY，Yoon JH，Kim KM，et al.Hypoxia stimulates proliferation of human hepatoma cells through the induction of hexokinase II expression［J］.J Hepatol，2005，42（3）：358-364.

[8]赵亮，刘莉，王爽，等.采用蛋白质组学技术筛选大肠癌转移相关蛋白［J］.生物化学与生物物理进展，2006，33（5）：485-491.

[9]王娟，陆彬彬，李娟，等.磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达及意义［J］.现代肿瘤医学，2011，11（11）：2213-2216.

[10]王帅，郭昌龙，原伟光，等.不同转移能力肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973的比较蛋白质组学研究［J］.国际遗传学杂志，2007，30（4）：249-253.

[11]Chen G，Gharib TG，Wang H，et al.Protein profiles associated with survival in lung adenocarcinoma［J］.Proc Natl A－cad Sci U S A，2003，100（23）：13537-13542.

[12]黄凌瑾，陈胜喜，黄燕，等.非小细胞肺癌细胞分泌蛋白谱的鉴定［J］.肿瘤研究与临床，2005，17（6）：364-367.

[13]Evans MJ，Saghatelian A，Sorensen EJ，et al.Target discovery in small-molecule cell-based screens by in situ proteome reactivity profiling［J］.Nat Biotechnol，2005，23 （10）：1303-1307.

The Expression of Phosphoglycerate Mutase 1 in Gliomas and its Significance

MA Jin1,GAO Yilu2
（1Department of Neurosurgery，the First People Hospital of Kunshan,Jiangsu 215300；2Department of Neurosurgery，the Affiliated Hospital of Nantong University）

Objective：To detect the expression of PGAM1 in gliomas and to explore the role of PGAM1 in the malignant growth of gliomas.Methods：RT-PCR was used to detect the expressions of PGAM1 in rat C6 cells and astrocytes. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of PGAM1 in human gliomas and the tissues around them.Results：The expression of PGAM1 in rat C6 cells was significantly higher than that in astrocytes(P<0.05).The expression of PGAM1 in human glioma specimens was significantly higher than that in the tissues around(P<0.05).Conclusions：Maybe PGAM1 is related to the malignant growth of human gliomas.

Glioma;Phosphoglycerate mutase 1 Glycolysis;RT-PCR;Immunohistochemistry

R739.41

A

2014-10-16

1006-2440（2014）06-0613-03

马进，男，汉族，江苏昆山人，生于1974年1月，硕士研究生，主治医师。研究方向：脑肿瘤，急性头颅外伤。