周业娣，张玉泉

（1南通市妇幼保健医院妇产科，江苏226001；2南通大学附属医院妇产科）

重度子痫前期患者胎盘中EPO及EPOR的表达

周业娣1*，张玉泉2

（1南通市妇幼保健医院妇产科，江苏226001；2南通大学附属医院妇产科）

目的：研究重度子痫前期患者胎盘中促红细胞生成素及促红细胞生成素受体的表达。方法：选择重度子痫前期患者20例和正常妊娠孕妇10例，采用免疫组化染色SP法观察两组胎盘中EPO及EPOR的定位和表达量的差异。用逆转录-聚合酶链反应检测两组胎盘组织中的EPO及EPOR的mRNA表达水平的差异。结果：EPO及EPOR主要表达于胎盘合体滋养细胞和血管内皮细胞，绒毛间质无明显的阳性染色。重度子痫前期组患者胎盘中EPO、EPOR的表达水平与正常孕妇组比较明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。重度子痫前期组中EPO及EPOR表达水平呈正相关（r=0.86，P<0.05）。结论：重度子痫前期患者胎盘中EPO及EPOR的表达明显高于正常妊娠组，且EPO及EPOR表达呈明显的正相关。EPO及EPOR表达改变在妊娠高血压疾病中有重要的作用。

重度子痫前期；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；胎盘；免疫组化SP法；逆转录聚合酶链反应

妊娠期高血压疾病（hypertensive disorders complicating pregnancy，HDCP）是妊娠期特有的疾病，包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及慢性高血压合并妊娠。临床以妊娠20周后出现高血压、水肿、蛋白尿为特点，并伴有全身多脏器的损害。我国发生率9.4%~10.4%，国外7%~ 12%[1]，其中重度子痫前期（severe pre-eclampsia）病情非常凶险，严重危害母儿健康，是导致围产期母儿并发症和死亡率增高的重要原因之一。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一类新发现的促血管生成因子，通过与促红细胞生成素受体（erythropoietinreceptor，EPOR）结合引发信号转导，具有促进血管生成、抗凋亡、抗缺氧作用，参与胎盘血管的发生、肿瘤血管的形成及转移等过程。促红细胞生成素及受体对正常妊娠的维持起了非常重要的作用，胎盘是其生成的重要组织，其异常的表达可能与病理性妊娠发病有关。选取在南通大学附属医院、南通妇幼保健院及南通瑞慈医院2009年6月—12月住院分娩重度子痫前期患者20例，研究重度子痫前期胎盘中EPO及EPOR的表达情况，探讨EPO及EPOR与重度子痫前期疾病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 重度子痫前期组患者20例，平均年龄（24.85±3.67）岁，平均孕龄（259±12.60）天，分类和诊断标准参照全国高等学校教材《妇产科学》第七版。以同期正常妊娠孕妇10例为对照组，平均年龄（27.40±1.35）岁，平均孕龄（275±8.22）天，两组孕妇年龄、孕龄具有可比性。两组孕妇均排除其他妊娠合并症及并发症。两组病例均经剖宫产结束分娩，术前均未进入产程。

1.2 方法 （1）标本采集：胎盘娩出后立即在胎盘母面，避开钙化区取组织1.0cm×1.0cm×1.0cm大小，分为两部分，一部分用等渗的生理盐水冲洗3遍，放入EP管中置于－80℃冰箱保存，用于蛋白提取；另一部分组织放于含10%的多聚甲醛液中固定保存24~ 48小时后，石蜡包埋组织切片。（2）免疫组化SP法：观察两组胎盘中EPO及EPOR表达，兔抗人EPO抗体，兔抗人EPOR抗体，SP免疫组化试剂盒（美国GBI公司），免疫组化染色按试剂盒说明操作。（3）逆转录聚合酶链反应：RT-PCR检测两组胎盘组织中的EPO及EPOR的mRNA表达，用Trizol法提取50~100mg胎盘组织总RNA。根据Fermentas公司RevertAtidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明进行反转录。EPO引物序列：上游5‘-TATGCCTGGAAGAGGATGGA-3’，下游5‘-GTGATTGTTCGGAGTGGAGC-3’，扩增引物大小257bp.EPOR引物序列：上游5‘-ATGATGGCTGCCTGTGGTGG-3’，下游5‘-AGGTCCTCACTGGGCGGGTT-3’，扩增引物大小223bp。EPO扩增反应条件：94℃预变性2min；94℃40sec，55℃40sec，72℃ 40sec 40个循环；72℃5min最后延伸，4℃冷却。EPOR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃ 45sec 30个循环；72℃5min最后延伸，4℃冷却。（4）结果判定：免疫组化以滋养细胞胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性，每个切片随机选取不重叠5个高倍视野（400×）。用NIS-Elements 3.0软件图像采集分析系统，分别计算每高倍视野的EPO及EPOR的平均光密度值，进而求出每例胎盘标本的EPO及EPOR平均光密度值。用Image 6.0电泳条带分析软件计算RT-PCR每1条带的平均灰度值，以灰度值大小代表mRNA的表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSSl3．0统计软件，计量资料以χˉ±s表示，组间差异性比较采用t检验，相关分析采用Pearson相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EPO及EPOR在两组胎盘中的表达 EPO及EPOR在正常妊娠和重度子痫前期患者胎盘中表达一致，在滋养层细胞染色最深，毛细血管内皮细胞次之，绒毛间质无明显的染色。计算平均光密度定量分析显示，EPO及EPOR在子痫前期患者胎盘中表达明显高于正常妊娠孕妇的水平，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1，表1。

图1 免疫组化法检测EPO及EPOR在子痫和正常妊娠胎盘中的表达（SP，×400）

表1 两组EPO及EPOR表达水平（平均光密度）比较（χˉ±s）

2.2 RT-PCR法EPO及EPOR在两组胎盘中的表达 与正常妊娠孕妇比较，EPO及EPOR在重度子痫前期患者（图2，图3）胎盘绒毛组织中表达水平明显高于正常妊娠组，差异均有统计学意义（P<0.05）。两组EPO及EPOR表达见表2。

图2 重度子痫组EPO mRNA的表达

图3 重度子痫组EPOR mRNA的表达

表2 两组胎盘中EPO及EPOR表达水平（平均灰度值）比较（χˉ±s）

2.3 EPO/EPOR相关分析 重度子痫前期组，胎盘绒毛组织中EPO表达水平与EPOR表达水平呈正相关（r=0.86，P<0.05），见图6。

3 讨 论

3.1 重度子痫前期胎盘发生的病理改变 妊娠高血压疾病临床以妊娠20周后出现高血压、水肿、蛋白尿为特点，分娩后即胎盘娩出后，症状特征不经治疗即可以缓解甚至消失，胎盘的病理改变在妊娠高血压疾病中起了非常重要的作用。胎盘是维系胎儿与母体的重要器官，胎盘结构和功能的正常是胎儿在宫腔内能否生存的重要条件。

正常妊娠时受精卵借于滋养细胞着床于子宫，进而依靠胎盘作为桥梁联系着母体和胎儿。滋养细胞妊娠第10周开始就侵入蜕膜成为绒毛外滋养细胞，进一步侵入子宫螺旋动脉，逐步取代血管内皮细胞，向肌层侵入。使子宫和蜕膜发生生理性的血管重铸，螺旋动脉向更宽敞、更低阻力的方向重建。血管直径至少4倍于未妊娠的血管，深度达子宫肌层的1/3，保证子宫胎盘足够的血流量，保证孕期胎儿生长发育的需要。妊娠高血压疾病的病因和发病机制至今仍不清楚，但是胎盘存在病理改变已被广泛证实。妊娠高血压疾病患者，螺旋动脉的侵入能力下降，滋养细胞侵入不足，螺旋动脉生理变化仅限于蜕膜段。子宫肌层内没有发生螺旋动脉血管的生理重铸，胎盘床中仅30%～50%的螺旋动脉被滋养细胞侵入[1]，子宫胎盘血流阻力增加，胎盘缺血缺氧，进一步导致血管内皮功能损伤，导致胎盘功能受损。胎盘缺血缺氧进一步加重病情，形成恶性循环，导致子痫前期乃至子痫的发生。

3.2 EPO及EPOR的来源及在妊娠中的作用 EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，主要有165个氨基酸组成。早期EPO产生于卵黄囊，肝脏是胎儿时期EPO合成的主要器官，后逐渐转移至肾脏产生。成年后主要由肾小管间质细胞分泌入循环，促进晚期红系祖细胞的繁殖、分化和以后的逐渐成熟，EPO必须通过结合EPOR才能发挥其功能。EPOR是细胞因子受体超家族中造血生长因子受体家族成员，是一种单链跨膜糖蛋白。EPO结合EPOR后可激活EPO/ EPOR信号转导途径，刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，参与抗凋亡、抗缺氧、促进新生血管生成、协同相关细胞因子效应、营养组织细胞等多种病理生理学过程。

EPO作为促进红系祖细胞增殖和分化的造血生长因子，对于成人有刺激骨髓造血的作用。在胎胚发育期对于维持胚胎的发育、促进脑、心脏和血管的形成和提高胎儿对缺氧的耐受性都具有重要的生理作用。近年研究发现，EPO和EPOR在胎儿的非造血组织如脑、眼及胎盘均有表达[2-4]，这些部位可能是胎儿体内EPO的来源。这种EPO及EPOR在胎盘组织随孕周增加表达增强的趋势[5]，反映EPO除促进造血功能以外，与妊娠的维持及胎儿的生长发育存在必然的联系。在妊娠早期流产、葡萄胎的胎盘组织中EPO及EPOR表达增高[6]。羊水中和脐带血中升高的EPO可作为胎儿慢性缺氧和亚慢性缺氧的标志，且与妊娠高血压时胎儿并发症的发病率相关[7]。有研究报道血清EPO的浓度与子痫前期的发生有关，子痫前期的孕妇，肾动脉灌注减少使组织相对缺氧，促进了EPO产物增加[8]。在生长受限的胎儿中，血清EPO浓度的增加与胎儿心血管危害的严重程度有关[9]。EPO临床已应用于神经损伤后的保护[10]，肾性贫血治疗，心肌损伤的保护，白血病的治疗等。产科中可以应用于治疗妊娠合并的贫血，能够明显改善胎儿的预后。

3.3 EPO/EPOR与重度子痫前期胎盘病理改变 妊娠的全过程中人类胎盘组织中的氧含量持续变化着，滋养细胞的分化和功能随着胎盘氧含量的变化而变化。正常妊娠早期的胚胎发育和胎盘形成，滋养细胞是在一个相对缺氧的环境中发育的。低氧环境在孕期是必需的，但持续低氧对足月胎盘则是有害的。组织缺血缺氧是刺激EPO产生的主要因素，可上调EPO基因表达。在正常妊娠绒毛和蜕膜组织中，缺氧诱导的EPO增加，介导的血管生成和抗凋亡作用参与了胎盘的血管构建和胚胎发育。

EPO及EPOR在正常妊娠胎盘中，随着妊娠孕周的增加呈现表达增强的趋势[5]。子痫前期胎盘严重缺血缺氧，母儿也处于缺血缺氧状态。已经证实母儿血浆中的EPO及EPOR是升高的。本实验免疫组化的结果证实，EPO及EPOR在胎盘中主要表达在胎盘绒毛滋养细胞和血管内皮细胞，绒毛间质未见明显的染色，子痫组染色明显增多，EPO及EPOR的表达高于正常妊娠组。RT-PCR的结果证实子痫组mRNA水平的表达明显增高，且EPO及EPOR呈明显正相关。推测胎盘组织缺血缺氧，缺氧诱导因子HIF-1α表达明显升高，作为EPO主要的调节因子，诱导EPO表达上调，作为血管损伤的代偿机制，促进血管的修复。

综上所述，EPO及EPOR对正常妊娠的维持和胎儿的生长发育起重要的作用。胎盘是EPO及EPOR的重要生成部位，胎盘缺氧缺血的病理改变，上调了EPO及EPOR的表达。EPO及EPOR表达上调对改善胎盘缺氧状况、外源性重组人促红细胞生成素在某些病理妊娠中的治疗作用及其安全性等均有待进一步研究。

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Expression of EPO and EPOR in the human placenta with severe pre-eclampsia

ZHOU Yedi1，ZHANG Yuquan2
（1Department of Obstetrics and Gynecology,Jiangsu 226001;2Maternal and Children Health Hospital of Nantong,the Affiliated Hospital of Nantong University）

Objective:To detecte the expression of erythropoietin（EPO）and erythropoietin receptor（EPOR）in the human placenta of severe pre-eclampsia.Methods:Twenty patients with severe pre-eclampsia and ten normal pregnant women were selected.Immunohistochemical SP staining was used to observe the location and expression level differences of EPO and EPOR in placenta.Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to test the difference expression of mRNA of EPO and EPOR in placental tissue in two sets.Results:EPO and the EPOR were expressed mainly in placental syncytiotrophoblast and vascular endothelial cells,and there was no obvious positive staining in villous mesenchymal.Expression levels of EPO and EPOR with the severe pre-eclampsia group,compared with the normal pregnant women group,were significantly higher,and the difference was statistically significant（P<0.05）.In the severe pre-eclampsia group,EPO and EPOR expression was positively correlated（r=0.86,P<0.05）.Conclusion:Expression of EPO and EPOR in severe preeclampsia placenta was significantly higher than in the normal pregnancy group,and expression level of EPO and EPOR showed a significant positive correlation.EPO and EPOR expression changes in pregnancy-induced hypertension play an important role in disease.

severe pre-eclampsia;erythropoietin;erythropoietin-receptor;placenta;immunohistochemical SP staining;Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）

R714.24+6

A

2014-08-25

1006-2440（2014）06-0609-04

周业娣，女，汉族，江苏灌南人，生于1983年9月，硕士，住院医师。研究方向：妊娠期并发症的相关病理机制。 通信作者：张玉泉，E-mail：jsnt_zhangyuquan@163.com