盛 楠，叶 佳，杨晓清，张玉泉

（南通大学附属医院妇产科，江苏226001）

NES1在人子宫内膜腺上皮细胞及子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达

盛 楠*，叶 佳，杨晓清，张玉泉

（南通大学附属医院妇产科，江苏226001）

目的：研究正常上皮细胞特异性-1基因（normal epithelial cell specific-1，NES1）在人正常子宫内膜腺上皮细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达。方法：原代培养人子宫内膜腺上皮细胞，用免疫荧光定量PCR及Western blot的方法检测NES1在子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中的表达。结果：成功培养人子宫内膜腺上皮细胞；NES1在正常人子宫内膜腺上皮细胞中表达，表达定位在细胞质。NES1在Ishikawa细胞中表达较在子宫内膜腺上皮细胞中明显降低（P＜0.05）。结论：NES1基因表达缺失可能是子宫内膜癌的发生机制。

NES1基因；子宫内膜癌；子宫内膜腺上皮细胞；Ishikawa细胞

正常上皮细胞特异性-1基因（normal epithelial cell specific-1，NES1）又称作人组织激肽释放酶10 （human kallikrein 10，KLK10），属于人激肽释放酶家族（human kallikrein，KLK），是近年来新发现的一种抑癌基因[1]，在调控正常上皮细胞生长、分化等方面起作用。研究发现，NES1基因表达缺失和多种肿瘤的发生有关，并且对肿瘤的早期诊断和预后评价用重要意义[2-3]。NES1基因作为一种在上皮细胞中表达的抑癌基因,在人子宫内膜癌中的表达情况鲜有报道。本实验通过检测NES1在正常子宫内膜腺上皮细胞和子宫内膜癌细胞系中的表达，为深入研究其在子宫内膜癌发生、发展中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa（中国科学院上海细胞所）；PRMI 1640培养液，胎牛血清（Gybco）；Ⅱ型胶原酶（Sigma）；逆转录试剂盒（博日）；荧光定量PCR试剂盒（Invitrogen）；NES1鼠抗单克隆抗体（Santa）。

1.2 方法

1.2.1 细胞及细胞培养：参照文献[4]方法原代培养人子宫内膜腺上皮细胞，细胞爬片后进行细胞角蛋白和波形蛋白免疫荧光分析，鉴定细胞性质。Ishikawa为人高分化子宫内膜癌细胞株，由南通大学附属医院妇产科实验室保存。Ishikawa细胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的PRMI 1640培养液培养。

1.2.2 细胞免疫荧光染色：长有细胞的盖玻片用PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍；用0.5%Triton X-100进行膜通透10min，PBS洗3遍；加1%BSA37℃封闭2h,吸去,勿洗；NES1一抗（1∶100）4℃孵育过夜，PBS洗3遍后加二抗FITC（兔抗鼠，1∶500）4℃孵育2h，PBS洗3次,注意避光；加hochest染细胞核，再用PBS洗3遍后荧光猝灭剂封片；在荧光显微镜下观察。相同实验均重复3次。

1.2.3 荧光定量PCR：采用Trizol、氯仿/异丙醇法提取细胞中总RNA,按反转录试剂盒说明操作，反转录成cDNA后进行荧光定量检测。应用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物。NES1引物：上游：CGAAC GGATGAGCACGAT，下游：CCACGCCAGGGTAGAAGAC。β-actine引物：上游：TCATCACCATTGGCAA TGAG，下游：CAGTGTGTTGCGTACAGGT。采用25μL反应体系。预变性：1个循环，95℃30s，PCR反应：40个循环，95℃5s；60℃20s。相同实验均重复3次。

1.2.4 Western Blot检测：取出所提细胞蛋白煮沸5min后取20μg上样，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白（12%分离胶，5%浓缩胶），转移至PVDF膜上（300 mA，2 h），5%脱脂牛奶封闭非特异抗原2 h，按蛋白Marker切割PVDF膜，并分别用鼠抗人NES1单克隆抗体（1∶200）和鼠抗人β-actine单克隆抗体（1∶ 200）4℃孵育18h；TBST洗涤6次，每次5min。再加入1∶5 000稀释的羊抗鼠二抗，室温孵育2h，TBST洗涤6次，每次5min。最后凝胶成像仪检测，并采用Quaintity One分析软件进行条带分子量及灰度值的分析。相同实验均重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差表示，差异性比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原代培养人子宫内膜腺上皮细胞及鉴定 接种后4～6 d细胞体积增大，呈卵圆形或多边形，并有核分裂出现（图1）。采用对上皮细胞特异的细胞角蛋白抗体和对基质细胞特异的波形蛋白抗体进行免疫荧光染色，90%以上的子宫内膜腺上皮细胞角蛋白染色阳性，波形蛋白染色阴性（图2）。

图1 原代培养3天后（100×）

2.2 NES1在正常子宫内膜腺上皮细胞中的表达及定位 细胞免疫荧光检测NES1在人子宫内膜腺上皮细胞中有表达，表达定位在细胞质（图3）。

图2 子宫内膜腺上皮细胞鉴定，角蛋白阳性，波形蛋白阴性

图3 NES1在子宫内膜腺上皮细胞质中表达

2.3 NES1mRNA在人子宫内膜腺上皮细胞及Ishikawa细胞中的表达 子宫内膜腺上皮细胞中NES1 mRNA高表达，而子宫内膜癌细胞系Ishikawa NES1 mRNA表达较低。Ishikawa细胞中 NES1 mRNA表达较正常腺上皮细胞均明显下降（P＜0.05）（图4）。

图4 NES1m RNA在子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中的相对表达量

2.4 NES1（KLK10）蛋白在人子宫内膜腺上皮细胞及Ishikawa细胞中的表达 子宫内膜腺上皮细胞中NES1蛋白高表达，而子宫内膜癌细胞系IshikawaNES1蛋白表达较低，且较正常腺上皮细胞均明显下降（P＜0.05），见图5，图6。

图5 KLK10蛋白在子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中的表达

图6 子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中KLK10蛋白的相对表达量

3 讨 论

NES1基因在许多组织中普遍表达，Petraki等[5]用免疫组织化学方法，发现NES1的表达普遍存在于细胞质,而不具器官特异性。主要表达于腺上皮，如乳房、前列腺、子宫内膜、胃肠道等。NES1最早因为其在乳腺癌中表达下调而受到重视,被认为是一种新型抑癌基因。Dhar等[6]用原位杂交的方法检测了136例乳腺组织样本，发现NES1基因在正常乳腺组织和乳腺良性病变中正常表达，在乳腺恶性肿瘤中NES1基因表达下降或缺失，NES1的表达水平可作为乳腺癌发生发展过程中的一个分子标志。除了乳腺癌外NES1基因表达下降或缺失还和多种肿瘤的发生、发展有关。Lu等[2]发现NES1在肝癌组织中的表达明显下调。Zhang等[3]研究报道在78例非小细胞肺癌标本中，57.7%的标本中NES1表达明显下降。虽然NES1基因作为一种抑癌基因而被认识，但近来有研究发现在某些恶性肿瘤中NES1基因的表达反而是增高的，且NES1的高表达预示较差的预后。Koh等[7]研究发现NES1在卵巢癌组织中表达明显升高。2011年Talieri等[8]研究发现NES1在结直肠癌中表达增高，并且是不良预后的标志。他们提出NES1虽然被认为是一种抑癌基因，但其具体功能尚不明确，有待进一步的研究。

本课题通过培养子宫内膜腺上皮细胞及子宫内膜癌细胞Ishikawa，利用免疫荧光定量PCR及Wstern blot技术检测NES1基因在正常上皮细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达情况，发现免疫荧光检测提示NES1基因在子宫内膜腺上皮细胞中高表达，且主要表达在细胞质当中，这与Petraki等[5]的研究结果是相一致的。荧光定量PCR检测发现NES1 mRNA在子宫内膜腺上皮细胞中高表达，而在Ishikawa细胞中表达明显下降。Wstern blot检测发现NES1蛋白在Ishikawa细胞中的表达较其在子宫内膜腺上皮细胞中的表达明显降低，其结果与荧光定量PCR相吻合。本文的实验结果说明NES1基因表达的降低和子宫内膜癌的发生密切相关。考虑子宫内膜癌中NES1基因的失活可能与DNA甲基化有关，这为我们进一步在子宫内膜癌中研究NES1基因表达下调的机制提供了线索。

另外，与基因的突变、缺失、易位、重组等引起DNA序列改变最终导致的抑癌基因失活不同，DNA甲基引起的NES1基因失活是可以逆转的。应用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶核苷酸（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC或DAC）及其衍生物，能够有效逆转基因的甲基化状态，使基因再次表达[9]。NES1基因失活的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供新了的思路和方向。

[1]Goyal J，Smith KM，Cowan JM，et al.The role for NES1 serine protease as a novel tumor suppressor［J］.Cancer Res，1998，58（21）：4782-4786.

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[3]Zhang YW，Song HZ，Miao YF，et al.Frequent transcriptional inactivation of Kallikrein 10 gene by CpG island hypermethylation in non-small cell lung cancer［J］.Cancer Sci，2010，101（4）：934-940.

[4]Jacca S，Franceschi V，Colagiorgi A，et al.Bovine endometrial stromal cells support tumor necrosis factor alpha-induced bovine herpesvirus type 4 enhanced replication［J］.Biol Reprod，2013,88（5）：135.

[5]Petraki CD，Karavana VN，Luo LY，et al.Human kallikrein 10 expression in normal tissues by immunohistochemistry ［J］.J Histochem Cytochem，2002，50（9）：1247-1261.

[6]Dhar S，Bhargava R，Yunes M，et al.Analysis of normal epithelial cell specific-1（NES1）/kallikrein 10 mRNA expression by in situ hybridization,a novel marker for breast cancer ［J］.Clinical Cancer Research，2011，7（11）：3393-3398.

[7]Koh SC，Razvi K，Chan YH，et al.The association with age，human tissue kallikreins 6 and 10 and hemostatic markers for survival outcome from epithelial ovarian cancer［J］.Arch Gynecol Obstet，2011，284（1）：183-190.

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Expression of NES1 gene in human endometrial glandular epithelial cells and Ishikawa Endometrial adenocarcinoma cells

SHENG Nan，YE Jia，YANG Xiaoqing，ZHANG Yuquan
（Department of Gynaecology and Obstetrics,Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001）

Objective:To study the expression of normal epithelial cell-specific-1（NES1）gene in human endometrial glandular epithelial cells and Ishikawa Endometrial adenocarcinoma Cells.Methods:Human endometrial glandular epithelial cells and cell culture of Ishikawa Cells were primarily cultured;Expression of NES1 in human endometrial glandular epithelial cells and Ishikawa cells were detected by immunofluorescence,real-time PCR and Western-blot.Results:NES1 gene was expressed in the cytoplasm of human endometrial glandular epithelial cells.There was remarkably less expression of NES1 gene in Ishikawa cells than in glandular endometrial epithelial cells.Conclusion:The study suggested that loss or reduction of NES1 gene expression might play an important role in endometrial carcinoma occurrence.

NES1;Endometrial carcinoma;Endometrial Glandular Epithelial Cells；Ishikawa cells

R737.33

A

2014-10-17

1006-2440（2014）06-0605-04

盛楠，女，汉族，江苏南通人，生于1985年10月，硕士，住院医师。研究方向：妇科肿瘤病理与临床。