孙 佳，邵荣花，高卫真△

(1.天津泰达医院药剂科,天津 300457；2.天津医科大学,天津 300070)

半夏属中药的凝集素与其他属性天南星科的中药植物凝集素相同，均具有专一结合甘露糖的3个位点，并具有显著的中药抗虫性[1]。本文参照已知半夏中凝集素的基因序列进行引物设计[2]，选择PCR-RT法，自5种中药半夏中分别克隆出凝集素的基因片段，并选择相应软件对凝集素的基因片段分别给予分析，旨在研究半夏属中药凝集素的序列分析以及基因片段的克隆方法，为成功转移到其他药材植物中作准备，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

所选材料分别为三叶半夏、掌叶半夏、滴水珠半夏、石蜘蛛半夏和盾叶半夏。

1.2 方法

表1显示，对半夏属植物的总RNA进行提取，选择某公司提供的提取试剂盒，参照试剂盒说明按步骤操作。选择某公司提供的反转录试剂将cDNA的第一链合成。

表1 半夏RNA提取步骤

1.3 PCR-RT与引物的设计

参照掌叶半夏中药凝集素的基因编码中，其cDNA的序列信息对引物进行设计合成。其PCR的反应体系是 PCR ×1buffer，每L含1.5 mmol的MgCl2，其酶为1U的Taq，其引物为每升0.25 μmol/L，其模板为每升100 ng的cDNA与0.2 mmol/L 的dNTP，总体积是25μL。其中PCR的扩增程序是60℃温度下30 s退火，于94℃下30 s变性，72℃下1 min延伸，共完成循环35个，最后72℃温度下10 min延伸，将PCR产物选择1%的琼脂糖应用凝胶电泳给予检测。

1.4 中药凝集素的基因克隆与基因鉴定

将扩增产物应用1%的琼脂糖凝胶给予电泳并回收实施纯化，同T-pMD19载体进行连接，直至转化为感受态的DH5a当中，再将单菌落挑取，并接种于含有每升100 mg、LB联合Amp的培养基中，保持37℃状态下过夜培养。选择载体通用的引物进行菌落的PCR检测，最后对阳性转化子进行测序。

1.5 统计学方法

选择Proteomics Ex2PASy Server软件对蛋白质的功能位点以及生化特性进行预测分析，选择finder软件查找DNA序列中的ORF，选择Genescan软件推定半夏氨基酸序列。

2 结果

2.1 rRNA18S与rRNA28S均显示清晰条带并能够进行PCR-RT实验

2.2 5种中药半夏的序列碱基测得平均含量(表2)

表2 5种中药半夏的碱基含量对照

2.3 基金片段编码

表3显示，基因片段的编码分别为：三叶半夏170个氨基酸，掌叶半夏170个氨基酸，滴水珠半夏170个氨基酸，石蜘蛛半夏171个氨基酸，盾叶半夏107个氨基酸。并且所编码的肽链中，均具有功能位点，如糖基化N位点、磷酸化蛋白激酶C位点和磷酸化酪蛋白激酶Ⅱ位点。因为编码序列中突变的碱基因素，导致肽链氨基酸出现变化，因此具有多态性，且功能位点也存在差异。

表3 5种中药半夏基因片段的蛋白预测对照

3 讨论

半夏属中药植物主要为天南星科以及南星亚科，在全世界范围内约有7个品种，大多分布在中国，也可见于日本及韩国[3]。有文献记载，目前我国共发现5个品种，主要为三叶半夏、掌叶半夏、盾叶半夏、石蜘蛛半夏和滴水珠半夏，且均为我国所特有的种类，其主要分布在我国东部以及东南部的各省[4]，而盾叶半夏目前已经被列为罕见品种，达到濒危级别。另据文献报道，半夏属植物全部具有药用意义，属于天然珍贵药材[5]，并已延续应用了2000多年，被中国药典收载，不仅能够燥湿化痰，而且可以降逆止呕，同时还具有清痞散结等诸多治疗功效，可缓解痰饮喘咳，改善胸脘痞闷，对患者恶心呕吐以及眩晕之症也有显著效果[6]。三叶半夏活性蛋白还具有临床抗肿瘤的功效，其中滴水珠半夏也可治疗毒蛇咬伤等中毒病症[7]。

由于半夏的凝集素具有与甘露糖中蛋白质呈专一结合的属性，并属于中药单子叶植物中甘露糖的凝集素家族，所以能够表现出强效的抗虫活性[8]。据文献记载，于蓖麻籽的萃取物中，植物的凝集素被首先发现。另据研究显示，中药植物凝集素不仅含有单个或多个非催化性质的蛋白，并能够与单糖及多糖呈可逆性结合。中药植物的生长发育中，可采取不同方式在各个阶段有效避免病虫的毒性侵犯，同时能够抵御细菌与真菌，甚至病毒类病原体特异性的侵犯。据文献报道，半夏凝集素不仅能够凝集动物体内的血红细胞，同时能够在生长比较旺盛的机体内与肝癌细胞结合，导致其出现凝集，这也显示出中药在对肝癌进行治疗上的研究前景。本文选择Protein Predict 软件分析半夏属中5个中药植物凝集素的基因片段，并分析编码蛋白所在功能位点。经预测分析发现，中药半夏均含有丰富的磷酸化位点，可以对酪蛋白激酶Ⅱ与蛋白激酶C进行磷酸化，这为今后的临床治疗以及临床研究提供了重要的研究方向。

在对中药三叶半夏与中药石蜘蛛半夏凝集素的基因片段进行分析后发现，2种药材编码氨基酸的序列同中药掌叶半夏的凝集素基因以及相应的片段编码中氨基酸的序列，全部含有与酪蛋白激酶Ⅱ相同的4个磷酸化位点，其中掌叶半夏与滴水珠半夏以及盾叶半夏均只含有与酪蛋白激酶Ⅱ相同的2个磷酸化位点，显示2个位点缺失。同时，所得中药氨基酸序列均含有蛋白激酶C的1个磷酸化位点，而三叶半夏以及石蜘蛛半夏和已知的掌叶半夏中，其凝集素的基因片段、氨基酸序列的编码中，发现蛋白激酶C的磷酸化位点与滴水珠半夏以及盾叶半夏中其蛋白激酶C的磷酸化位点也有所不同。在掌叶半夏的凝集素基因中，其编码片段所属的氨基酸序列中，共包括N-糖基化的3个功能位点，由于在214位原有的核苷酸C已突变呈T，导致编码72位中的丙氨酸已变为缬氨酸，并导致中药三叶半夏以及石蜘蛛半夏中增加了N-糖基化的一个功能位点。由于核苷酸A于479位已突变呈G，导致核苷酸G于482位突变呈A，同时使得在酪氨酸Y于154位及甘氨酸G于155位上突变呈半胱氨酸C以及天冬氨酸D，进而三叶半夏以及石蜘蛛半夏均出现功能位点的缺失。上述基因的变异也预示着中药半夏会更多地用于临床治疗，中药将会在医学界打开一个暂新的局面。

综上所述，中药半夏的凝集素基因能够成功克隆，但是否能够成功转移到其他药材植物当中，以此获得新的抗虫中药植株和抗肿瘤中药植株，还有待进行更深层次的研究。

[1] 冯瑞娟. 半夏蛋白的提取分离、含量测定及对Hela细胞的作用研究[D].浙江理工大学,2012.

[2] 章伟标. 半夏蛋白的分离纯化及结构分析[D].浙江理工大学,2011.

[3] 王鸿儒,李培训. 李培训主任运用半夏泻心汤治疗肿瘤术后经验[J]. 西部中医药,2012,1(15):46-47.

[4] 俞婷婷,李伟平,丁志山. 半夏的应用及毒性认识[J]. 现代中药研究与实践,2012,2(21):79-82.

[5] 栾阳,张慧,康廷国. 掌叶半夏脂溶性成分GC-MS研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,2(19):52-54.

[6] 武峰,秦志丰,李勇进,等. 半夏化学成分抗肿瘤研究进展[J]. 中华中医药学刊,2013,2(22):270-272.

[7] 黄越. 复制缺陷型腺病毒Ad-pShuttle-CMV-p14ARF联合半夏凝集素对结肠癌细胞生长抑制的研究[D].浙江理工大学,2013.

[8] 孟庆华. 小半夏加茯苓颗粒体外抑瘤作用的实验研究[D].贵阳中医学院,2009.