刘韵然，游金坤，邓雅元，王 娟，杨璐敏，迟 蔚

（1.云南省供销合作社科学研究所，云南 昆明 650221；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

凝集素是一类不具有免疫原性和酶活性的蛋白质，包含一个或多个糖识别域，可与多种不同类型的单糖及低聚糖糖结构进行高度选择性和特异性的结合，而不改变其共价结构[1]。通常凝集素因其可凝集红细胞而被称为血凝素，但随着对凝集素研究的深入，发现并非所有血凝素均通过与细胞表面的糖可逆性结合来凝集红细胞，而只有凝集素才具有这种活性[2]。此外，凝集素依靠定向选择结合糖基从而特异性识别外源细胞，因此还具有免疫调节活性、促进有丝分裂、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、介导寄生生物与宿主间的相互作用[3]。目前，已经从植物、动物、微生物中分离纯化得到凝集素，并因其所具备的多种生物活性，在生物医学、免疫学中展现出广阔的应用前景。

大型真菌作为获取凝集素的新来源，引起越来越多学者的关注。随着对各类大型真菌药理学研究的深入，凝集素、多糖、三萜类等活性物质被提取和纯化，大型真菌的免疫调节、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性也被相继发现。目前，大型真菌凝集素因具有凝集细胞活性、激活淋巴细胞分裂、刺激分泌免疫细胞因子、可特异识别特定的肿瘤、抑制肿瘤生长等免疫调节作用而在生化、临床试剂开发领域有广泛的应用，并逐渐成为细胞癌变、细胞分化、细胞分子识别及病原菌检测等生命过程中有用的工具[4-5]。

1 大型真菌凝集素的结构

大型真菌凝集素通常由非共价相互作用结合2个到4个相同或不同的亚基组成[1]。目前，对于真菌凝集素结构的分析数据还十分有限，一些菌类凝集素，如荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes） 凝集素[6]等，显示出独特的结构折叠。被鉴定出的大多凝集素可以按照其晶体结构的折叠形式和特征大致分为4个折叠类型，包括β螺旋折叠、半乳凝集素样折叠、β三叶折叠和类海葵溶细胞素折叠。通过总结发现，结构相似的凝集素在一定程度上表现出部分相似的生物活性，为今后研究大型真菌凝集素的生物活性提供了思考方向。

1.1 凝集素β螺旋折叠结构

β螺旋结构家族中，以毡毛小脆柄菇（Psathyrella velutina） 凝集素[7]为代表，晶体结构呈七叶β螺旋折叠。晶粒鬼伞（Coprinus micaceus） 凝集素和角斑鬼伞（Coprinellus angulatus） 凝集素结构也被归类为毡毛小脆柄菇凝集素样结构[8]。相同折叠形式的还有橙黄网胞盘菌（Aleuria aurantia） 凝集素，呈六叶β螺旋折叠结构，具有与岩藻糖结合烟曲霉凝集素类似的多价糖识别结构域[9]。

1.2 凝集素半乳凝集素样折叠结构

与半乳糖凝集素同源的大型真菌凝集素从灰盖鬼伞 （Coprinopsis cinerea）[10]和柱状田头菇 （Agrocybe cylindracea）[11-12]中分离得到。从同担子菌亚纲的灰盖鬼伞中分离出来的3个凝集素CGL1、CGL2、CGL3及柱状田头菇凝集素AAL和ACG在无配体或是含β半乳糖苷低聚糖复合体的状态下，结构与动物半乳糖凝集素结构基本重合，除了CGL3在结构中一个色氨酸被精氨酸所取代而造成CGL3无法与乳糖结合。已经有大量研究表明半乳糖凝集素在动物中参与了免疫调节、细胞增殖与凋亡等生物调控过程[13]，大型真菌的半乳糖凝集素CGL2和ACG也都已经被证实能与TF抗原结合，从而调控肿瘤细胞凋亡[10，12]。

1.3 凝集素β三叶折叠结构

β三叶折叠家族凝集素与蓖麻毒素b链蛋白结构域相似，由α、β和γ三个重复的亚结构域组成，家族成员包括水粉杯伞（Clitocybe nebularis）凝集素CNL[14]、硫磺菌（Laetiporus sulphureus）凝集素LSL[15]、硬柄小皮伞（Marasmius oreades） 凝集素MOA[16]、宽鳞多孔菌 （Polyporus squamosus） 凝集素PSL[17]、高大环柄菇（Macrolepiota procera） 凝集素MPL[18]、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum） 凝集素SSA[19]和灰盖鬼伞中分离纯化的一种凝集素CCL2[20]及美味牛肝菌（Boletus edulis） 中的一种凝集素[21]。

有报道发现蓖麻毒素b链蛋白能与半乳糖/N-乙酰基半乳糖胺特定结构结合，具有调节免疫细胞活化的作用，促进小鼠脾脏淋巴细胞、CD4+T细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖活化[22]。多个具有蓖麻毒素b链蛋白结构的大型真菌凝集素同样被报道具有免疫调节活性[15-16，19，23]。Pohleven 等[23]研究证实水粉杯伞凝集素CNL是一种同型二聚体凝集素，每个单体包含一个蓖麻毒素b链蛋白结构域，并且仅有一个单一的碳水化合物结合位点位于每个单体的α重复序列上，其二价碳水化合物结合特性决定了其生物活性，CNL具有活化树突状细胞（dendritic cells，DCs）、抗人白血病T细胞增殖等生物活性。核盘菌凝集素SSA与CNL相似，只有一个结合位点位于α重复序列上，而硫磺菌凝集素LSL、硬柄小皮伞凝集素MOA和宽鳞多孔菌凝集素PSL则不同，其是由非凝集素结构域和凝集素结构域构成的模式蛋白，凝集素结构域特异识别作用目标，非凝集素结构域介导发挥其生物活性；PSL在β重复序列上有一个结合位点并与α重复序列上的氨基酸残基一起发挥作用，LSL则有2个结合位点分别位于β和γ重复序列上，而MOA有3个结合位点分别位于α、β和γ 3个重复亚结构域上。

1.4 凝集素类海葵溶细胞素折叠结构

红绒盖牛肝菌（Xerocomus chrysenteron） 凝集素XCL[24]与海葵溶细胞素的结构折叠形式高度相似，因此将XCL结构折叠称为类海葵溶细胞素折叠。在其他研究中，通过结构比对和蛋白质编码基因序列比对，发现双孢蘑菇（Agaricus bisporus） 凝集素ABL[25]和美味牛肝菌的一种凝集素BEL[21]与XCL的三维立体结构基本相同，蛋白质编码基因序列高度相似，并与黄白侧耳（Pleurotus cornucopiae） 凝集素[26]一起归类为盐溶性凝集素家族。此类凝集素晶体结构特点是有6个β折叠股和4个β折叠股分别构成的2个β折叠片层，这两个β折叠片层间通过螺旋-环-螺旋模体相连接。ABL中N-乙酰半乳糖胺与螺旋-环-螺旋模体上一侧低陷部分的糖结合位点的结合与BEL中单糖的结合非常相似。在研究中发现，ABL、BEL和XCL蘑菇凝集素都能与T抗原特异性结合，且ABL的抗增殖活性可以通过结合TF抗原二糖Galβ1-3GalNAc进行调节[27]。

2 大型真菌凝集素的糖特异性

凝集素作为大型真菌的一种贮藏蛋白，与植物凝集素相比分布范围广，且其表达水平高，表达随着环境、生长年龄等因素的改变而改变。目前已有许多研究发现，大多真菌凝集素从子实体中分离，还有部分仅在菌丝体中表达[28-30]。从不同品种的大型真菌中分离纯化的凝集素分子质量、亚基数量、糖特异性各不相同，有的大型真菌凝集素具有单一的糖特异性，有的则具有多个糖结合位点，这些结合位点使凝集素与外源细胞相互识别，进而发挥其免疫调节、抗肿瘤等生物学活性功能。

Hassan等[30]综合报道了国外大型真菌凝集素糖特异性的研究，国内外近十年间新增报道的大型真菌凝集素糖特异性补充见表1。

表1 大型真菌凝集素的糖特异性Tab.1 Carbohydrate specificity of macrofungi lectin

由表1可知，通过对比国内外已报道的大型真菌凝集素糖特异性，发现从不同产区同一品种大型真菌中分离得到的凝集素或是从同一菌株不同部位分离的凝集素，可能会有不同的糖特异性差异，也可能与试验所用红细胞来源不同有关。如从灵芝中分离出的凝集素，在Thakur[31]和Kawagishi[32]的报道中具有去唾液酸胎球蛋白和胎球蛋白的糖蛋白特异性，而在郭栋等[32]的研究中还发现其凝血活性能被木糖和D-果糖抑制。柱状田头菇凝集素在报道中被乳糖、半乳糖和半乳糖胺抑制凝血活性[30]，但孙慧等[34]分离纯化的一种新柱状田头菇凝集素却不与乳糖、半乳糖等发生特异性结合，反而被猪胃黏蛋白强烈抑制其凝血活性。

另外，部分大型真菌凝集素的糖特异则表现出专一性及稳定性。王文君等[35]发现了葡萄糖是姬松茸凝集素的专一结合糖。黄牛肝凝集素不与单糖和低聚糖发生特异性结合，而被胃粘蛋白强烈抑制凝血活性，与甲状腺球蛋白、卵粘蛋白和卵清蛋白呈现浓度依赖性结合[36]；鳞柄小奥德蘑显示出N-乙酰半乳糖胺特异性[37]；香菇凝集素被乳糖单一特异性结合[33]；乳菇凝集素的凝血活性被N-乙酰半乳糖胺抑制[38]。

糖特异性是大型真菌凝集素调节机体免疫的决定性因素[12，21]。如柱状田头菇凝集素ACG与TF抗原的识别主要通过与N-乙酰半乳糖胺的交互，BEL也是通过与TF抗原双糖Galβ1-3GalNAc结合抑制肿瘤细胞增殖。因此研究大型真菌的糖特异性，可为进一步探究大型真菌凝集素活性功能的机理提供更多基础数据。

3 大型真菌凝集素免疫调节作用的相关研究

大型真菌凝集素免疫调节作用的相关研究已经是其生物活性中重要的一部分，大型真菌凝集素可以通过免疫监视、激活巨噬细胞、致敏T淋巴细胞、B淋巴细胞、促进淋巴细胞有丝分裂、促细胞因子分泌等多种途径来发挥免疫调节功能。

3.1 大型真菌凝集素的免疫监视作用

蛋白质糖基化贯穿于细胞的识别、信号传导、细胞活化等过程中，异常的糖基化修饰新产生的肽链结构及位置，均会在免疫应答中产生影响，导致肿瘤免疫监视逃逸[49]。在关于糖基化与免疫监视相关的报道中，已经有大量研究证实肿瘤细胞表面表达出异常的糖基化修饰，如核心岩藻糖基化水平与胃癌细胞增殖程度呈现负相关，当核心岩藻糖基化水平下降时会导致胃癌细胞发生免疫逃避。另外N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT） 糖基化和氧连N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc） 糖基化也通常在肿瘤细胞表面表达，因此靶向结合聚糖的生物治疗手段得以重视[50]。

如前面所述，大型真菌凝集素的结构特征决定了其糖特异性，不同的大型真菌凝集素具有不同的糖特异性。而肿瘤的异常糖基化修饰是其癌变的重要特征，激活肿瘤免疫的有效手段之一即研究不同类型糖基化对肿瘤的影响。大型真菌凝集素的糖特异性特征在对肿瘤细胞的识别中可以发挥重要的作用，在细胞发生肿瘤恶变，或肿瘤细胞向正常组织浸润时，优先对非正常细胞进行识别，可以作为免疫监视、靶向治疗的重要佐剂。Kobayashi等[44]从翘鳞伞中分离纯化的凝集素PhoSL对核心α1-6-岩藻糖基化N-聚糖稳定特异性结合，对岩藻糖基化甲胎蛋白具有很高的识别和结合作用，而岩藻糖基化甲胎蛋白在肝癌细胞中大量表达，从而认为PhoSL对肝癌细胞具有一定的免疫监视作用。

3.2 大型真菌凝集素激活免疫细胞

目前，已有学者对大型真菌凝集素活化免疫细胞的信号通路进行了研究，上游信号通路包括凝集素调节膜钙离子通道或结合细胞表面Toll样受体（toll-like receptors，TLRs） 通道均已经被证实。

草菇（Volvariella volvacea） 凝集素VVL被报道可以通过作用于L型钙离子信号通道对T细胞钙离子内流进行有效调控，L型钙通道在T细胞受体（T cell receptors，TCR） 介导T细胞活化和增殖中至关重要，进而认为VVL通过TCR信号通道实现T细胞增殖和免疫应答[51]。

此外，由于凝集素具有的糖特异性，大多数文献报道中认为大型真菌凝集素激活免疫细胞主要通过TLRs信号转导[52-53]。TLRs是一类主要存在于免疫细胞表面的跨膜蛋白，不同的TLRs对不同的配体进行识别，以传递信号产生适应性免疫调节。TLRs通路活化包括2个主要信号过程，凝集素与免疫细胞表面受体的相互结合是激活细胞的第一信号，结合了的TLRs被触发与细胞内接头蛋白分子相结合为第二信号。第二信号的识别与结合主要有2种途径，髓样细胞分化因子MyD88依赖途径和非依赖途径，而后激活下游信号表达。

目前已经被证实是通过TLRs信号通路发挥免疫应答的菌类凝集素主要有水粉杯伞凝集素CNL、糙皮侧耳凝集素POL和硫磺菌凝集素LSL，其中CNL和LSL都属于β三叶折叠凝集素家族。Svajger等[53]发现CNL在10 μg·mL-1浓度下对TLR4活化能力与细菌脂多糖的激活能力相似，通过培养人TLR4细胞系，采用MyD88抑制剂和TLR4小分子特异性抑制剂CLI-095，以及单克隆抗体标记等方式，最终确定CNL通过TLR4/NF-κB方式介导激活DCs，产生TH1辅助细胞极化反应引发免疫应答。

Meina等[55]通过监测POL作用后TLR6的表达和TLR6的敲除试验，证实POL与DCs表面TLR6特异性结合，刺激滤泡辅助性T细胞反应，产生慢性乙型肝炎病毒特异性抗体，引起免疫应答。Wang等[56]的研究则表明LSL主要通过TLR4信号通路作用于巨噬细胞。其他在凝集素与TLRs信号通路相关的综合报道中提到的大型真菌凝集素则是通过凝集素的结构特点及下游细胞因子的检测来推断其信号通路，而事实上是否是通过TLRs通路进行免疫细胞激活还需要更多的研究依据。

3.3 大型真菌凝集素刺激细胞因子分泌

凝集素特异性结合受体能引起多种免疫细胞因子的分泌，如TLRs介导的促有丝分裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号转导通路和核因子 κB（NF-κB）通路，或是细胞外信号调节激酶，巨噬细胞的经典活化（M1） 和选择性活化（M2） 等免疫调控相关途径促进细胞因子分泌。Cheung等[57]通过检测MAPK通路的分支路线Erk、Jnk、p38、Akt的磷酸化状态和p53的表达水平，发现双孢蘑菇凝集素ABL通过抑制Akt通路来抑制人视网膜色素上皮细胞的增殖。此后Ditamo等[58]发现ABL作用于巨噬细胞，通过转变AKt信号通路，抑制NO的产生，同时作用于T细胞，降低先天免疫和适应性辅助性T细胞Th1反应，可以控制炎症性自身免疫。黄东等[59]的研究中发现黑木耳凝集素通过NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞，促进细胞因子分泌进行免疫调节。Svajger等[54]在确定了水粉杯伞凝集素CNL通过TLR4激活DCs后，同样检测了其下游信号通路NF-κB和p38 MAPK的激活水平，发现CNL通过下游信号通路NF-κB途径调节免疫。

另外，双孢蘑菇凝集素ABL和草菇凝集素VVL可以激活蛋白酪氨酸激酶p56lck进行免疫调节。p56lck属于非受体型蛋白酪氨酸激酶，且VVL被证实通过TCR调控T细胞有丝分裂，因此ABL和VVL对p56lck的激活途径是由TCR通道活化T细胞，而并非通过MAPK信号通路转导[60]。很多受体分布于巨噬细胞的表面，不同的刺激源与不同的受体结合，通过下游信号通路如JAK-STAT信号通道、NF-κB信号通道等，刺激巨噬细胞M1或M2活化分泌不同的细胞因子。北虫草（Cordyceps militaris）凝集素可以通过提高STAT1 S727位点的磷酸化水平或是p38-T180/Y182的磷酸化水平，激活巨噬细胞M1型分化[61]。除此之外，大量的研究报道为大型真菌凝集素促免疫细胞因子的分泌提供了重要的试验依据，见表2。

表2 大型真菌凝集素刺激细胞因子分泌Tab.2 Promoting cytokine secretory activity of macrofungal lectins

由表2可知，凝集素靶向作用于免疫细胞如巨噬细胞、DCs或辅助性T细胞，分别通过不同的信号通路刺激分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素 （IL-2、IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β）、乙型肝炎病毒抗体等，从而发挥免疫调控作用。

3.4 大型真菌凝集素促进免疫细胞增殖

研究表明大型真菌凝集素能促进免疫细胞的有丝分裂，部分真菌的促细胞增殖情况见表3。

表3 大型真菌凝集素促细胞增殖Tab.3 Proliferation effect of macrofungal lectin

如表3所示，柱状田头菇凝集素、毛木耳凝集素、黑管菌凝集素、金针菇凝集素、灵芝凝集素、梯棱羊肚菌凝集素、阿魏菇凝集素、草菇凝集素和砖红绒盖牛肝菌凝集素等均对小鼠脾细胞或脾淋巴细胞有增殖促进作用。其中草菇凝集素被证实是通过TCR/钙离子信号通道诱导细胞有丝分裂[72]。另外，灵芝凝集素、白茯苓凝集素能促进人淋巴细胞有丝分裂。细网牛肝菌凝集素和草菇凝集素能促胸腺细胞增殖。通过促进免疫细胞的增殖，调节机体的免疫活性。

4 结语

与其他动植物凝集素相似，大型真菌凝集素在结构上包含一个或多个糖识别域，高度选择性和特异性结合多种糖，可以在免疫系统中细胞间的相互识别、信号传导、细胞分化等多个生物过程中发挥重要作用。通过研究大型真菌凝集素的晶体结构和糖特异性，可发现结构相似或可结合相同糖分子的大型真菌凝集素，有一部分表达出相似的生物活性。特异性识别是大型真菌凝集素发挥免疫调节功能的主要方式，大型真菌凝集素可以通过免疫监视、活化免疫细胞、刺激分泌免疫细胞因子以及促进免疫细胞有丝分裂等方式来调节机体免疫，发挥免疫调控功能。大型真菌作为凝集素的新来源，成本经济，生长周期短，在开发药物靶向载体、免疫佐剂、定位识别等生物医学领域有广阔的应用前景。