张淑群 高晓燕 薛兴欢 马一楠 马兴聪

·基础研究·

黄芩素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株SATB1表达的影响*

张淑群 高晓燕 薛兴欢 马一楠 马兴聪

目的：观察黄芩素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞SATB1蛋白表达的影响。方法：用MTT法、划痕愈合实验观察不同浓度黄芩素干预后MDA-MB-231细胞增殖和运动迁移能力的变化；用Western Blot法检测黄芩素干预后MDA-MB-231细胞SATB1蛋白表达的变化。结果：随作用时间的延长和药物浓度的增加，黄芩素对MDA-MB-231细胞增殖和运动迁移的抑制作用逐渐增强，呈明显的时间-剂量依赖性（P＜0.05）；黄芩素可显著降低MDA-MB-231细胞中SATB1蛋白的表达，而且随着药物浓度增加，SATB1蛋白表达量逐渐减少（P＜0.05）。结论：黄芩素可通过抑制SATB1的表达抑制肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭和迁移能力。

黄芩素 SATB1 乳腺癌 细胞株

Department of Oncology,the SecondAffiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University School of Medicine,Xi'an 710004,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81274136),Xi'an Jiaotong University's

Cross Project Funds(No.Xjj2012141),and the Talent Funds of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University(No.RCCGG201105)

乳腺癌在全球女性肿瘤病死率中排第二位［1］，患者死亡的主要原因是肿瘤细胞在身体其他部位的播散和增殖，约有50%的乳腺癌患者初诊时已有远处转移［2-3］，因此目前治疗的难点和关键是预防和控制肿瘤的转移。特异富含AT序列结合蛋白1（special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1），是一种组织特异性核基质结合蛋白，在胸腺细胞、祖细胞和上皮基底层显著表达，在其他正常细胞和组织中几乎不表达，参与染色质高级结构的形成和组织特异性基因表达的调控，在T细胞的发育、早期红细胞分化，细胞稳态和响应各种刺激中起重要作用［4-10］。近来研究发现SATB1在多种肿瘤细胞中异常高表达，能调控1 000余种肿瘤相关基因，促进肿瘤的生长和转移。被认为是一个潜在的重要的抗肿瘤药物作用的靶分子。

黄芩素是从中药黄芩中分离出来的单体，其分子式为C15H10O5，分子量为270.24（图1）。研究发现黄芩素在人乳腺癌、肝癌、胰腺癌等细胞株中具有抑制肿瘤细胞增殖和侵袭转移的作用［11-13］。然而其抗肿瘤生长和转移的具体分子机制尚不清楚。本研究结果提示，在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中黄芩素可通过抑制SATB1蛋白的表达而发挥抗肿瘤侵袭转移作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自上海生物研究所细胞库；黄芩素购自美国Sigama公司，纯度为99%；兔抗人SATB1多克隆抗体购自美国Abcam公司；鼠抗人β-Actin单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京博奥森生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及药物处理 MDA-MB-231细胞加入含10%胎牛血清的1640培养基，当细胞铺满瓶壁80%时传代。

1.2.2 MTT法检测黄芩素对MDA-MB-231细胞增殖的影响 取对数生长期的细胞，制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，以200 μL/孔种于96孔板，孵育24 h。用含10%血清的1640培养液将黄芩素储存液（0.1 M）配置成终浓度为5、10、20、40、80 μmoL/L的培养液。96孔板中加入200 μL不同浓度的黄芩素培养液。空白对照组加入200 μL普通细胞培养液。每个浓度设6个平行复孔。继续培养分别于24 h，48 h，72 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，培养4 h后弃掉原液，加入MDSO 150 μL/孔。振荡10 min，酶标仪在490 nm波长下测定各孔光密度（optical density，OD）值，记录结果。细胞增殖抑制率（inhibition ratio，IR），IR=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%；计算出黄芩素的48 h的50%抑制浓度（IC50）。

1.2.3 划痕试验检测黄芩素对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 按1.0×105个/mL密度，将细胞接种于6孔培养板中，当细胞生长融合达80%时，用200 μL的移液器枪头划痕，记录划痕区相对距离。加入含黄芩素浓度分别为0、10、20 μmol/L的维持培养液继续培养，分别于0、24、48 h 3个时间段分别观察并照相。每组2个复孔，实验重复3次。倒置显微镜下测量细胞向划痕区迁移的相对距离，根据原始细胞划痕区宽度计算出细胞实际迁移距离。

1.2.4 Western Blot法检测黄芩素对MDA-MB-231细胞SATB1蛋白表达的影响 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，半干转印到PVDF膜，5%的脱脂奶粉中封闭90 min，加一抗（SATB1 1.25∶1 000，β-actin 1：1 000）4℃过夜；洗膜后加入1：1 000的二抗稀释液室温下孵育1 h。ECL显色曝光，凝胶成像系统进行扫描分析；实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄芩素体外抑制MDA-MB-231细胞的增殖

与对照组比较，黄芩素在24、48、72 h及各浓度（5、10、20、40、80 μmol/L）均对MDA-MB-231细胞有抑制作用。随着药物浓度的提高和培养时间的延长，黄芩素对MDA-MB-231细胞的抑制作用逐渐增强，即具有时间-剂量依赖性（表1，图2）。通过SPSS 18.0软件计算出黄芩素对MDA-MB-231细胞作用48 h的半数增殖抑制浓度（IC50）为27.92 μmol/L。

2.2 黄芩素对MDA-MB-231细胞体外迁移能力的影响

细胞运动能力的检测也是一种判断肿瘤细胞转移潜能的方法。本实验将待测细胞分为3组，对照组、10 μmol/L及20 μmol/L黄芩素干预组。倒置显微镜下可见对照组与浓度为10 μmol/L的黄芩素组MDA-MB-231细胞形态无明显变化，而作用48 h后浓度为20 μmol/L黄芩素干预组细胞形态发生明显变化，由原来的长梭形变为类圆形。分别于划痕后0、24、48 h观察并记录细胞划痕区的愈合情况。黄芩素干预组划痕区细胞迁移的数量明显少于对照组，药物干预组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着药物浓度的提高，划痕区愈合宽度明显减少（图3）。

表1 黄芩素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响（±s，n=6）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）24 h 48 h 72 h 0 5 OD 0.406±0.031 0.482±0.013 IR（%）0 -22.84 OD 0.603±0.036 0.533±0.051 IR（%）0 13.20 OD 0.981±0.027 0.841±0.063 IR（%）0 14.27

表1 黄芩素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响（±s，n=6）（续表1）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）10 20 40 80 24 h 48 h 72 h OD 0.408±0.052 0.338±0.029 0.316±0.016 0.264±0.014 IR（%）-6.53 20.63 27.26 42.67 OD 0.507±0.033 0.356±0.025 0.283±0.022 0.207±0.023 IR（%）18.18 46.90 60.49 74.76 OD 0.824±0.025 0.465±0.011 0.212±0.030 0.193±0.014 IR（%）20.08 52.60 78.39 80.33

2.3 Western Blot检测黄芩素对MDA-MB-231细胞SATB1蛋白表达的影响

根据MTT法检测结果求出的黄芩素对MDA-MB-231细胞增殖的48h半数抑制浓度（IC50），选用浓度分别为0、10、20、40 μM的黄芩素处理细胞MDA-MB-231 48 h后，分别提取细胞总蛋白用于Western Blot检测。结果如图4所示，与空白对照组比较，不同浓度的黄芩素（10、20、40 μM）分别干预MDA-MB-231细胞48h后，SATB1蛋白的表达均降低，差异有统计学意义（P＜0.01），且随药物浓度的提高，SATB1蛋白表达量逐渐减少（P＜0.05）。说明黄芩素可降低MDA-MB-231细胞中SATB1蛋白的表达，且呈浓度依赖性。

3 讨论

癌细胞的异常生长和转移是癌症的重要生物学特性。侵袭转移是数百万癌症患者发病和死亡的主要原因［14］。筛选有效的不良反应小的抗肿瘤侵袭转移药物，对提高乳腺癌疗效、改善预后、提高生存质量，具有重要的意义。黄芩素是从黄芩中提取出来的黄芩苷苷元化合物，研究显示其具有较强的抗癌活性，可抑制乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549、4T-1的增殖、降低其侵袭迁移能力及，可使MMP-2、MMP-9、uPA、NF-κB蛋白表达下调［11，15-18］，但具体作用机制目前尚不清楚。本研究采用MTT法观察不同浓度梯度黄芩素对MDA-MB-231细胞增殖的影响，结果显示黄芩素具有抗肿瘤细胞增殖的作用，且呈时间-剂量依赖性（P＜0.05）。迁移是肿瘤细胞转移过程中必不可少的环节之一；划痕愈合实验被广泛用于二维水平细胞迁移运动能力的研究。本实验发现黄芩素具有抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞运动迁移的作用。这同Wang等［11］的研究报道一致。

SATB1是一种组织特异性的核基质结合蛋白，它以独特的“笼状”结构锚定于染色质，能为众多转录因子提供作用位点，在基因转录过程中发挥重要作用［7］。Han等［19］发现SATB1在乳腺癌组织中异常高表达，可促进乳腺癌细胞的生长和转移，在肿瘤演进过程中发挥关键作用。基因组学研究发现SATB1通过调控1 000个以上基因（主要是调控细胞粘附、细胞信号、ECM形成和细胞周期）的表达促进肿瘤侵袭转移。SATB1水平增加的细胞其促进肿瘤发展和转移的基因上调（包括ERBB2、MMP2，3，9、ABL1、E-cadherin），而转移抑制基因的表达被抑制。这些SATB1所调控的基因是通过比较高侵袭性人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞在SATB1基因敲除前后基因表达谱的变化得出的。Zhang等［20］报道在结肠癌组织中，SATB1的表达与多种生物学和遗传学标记的表达呈正相关（包括Cyclin D1、MMP2、NF-κB、PCNA），同时与APC和BRAF（V600E）表达的缺失相关。本研究黄芩素是否通过抑制SATB1的表达从而发挥抗肿瘤细胞增殖及侵袭转移的作用。实验结果发现小剂量黄芩素干预乳腺癌MDA-MB-231细胞，可下调SATB1蛋白的表达，且随剂量增加抑制作用显著增强（P＜0.01），提示下调SATB1蛋白表达可能是黄芩素抑制乳腺癌侵袭转移的机制之一。

综上所述，黄芩素可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭和转移，提示黄芩素可能具有潜在的抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用。本实验首次发现黄芩素可下调SATB1蛋白的表达，提示黄芩素可能通过抑制SATB1的表达而发挥抗肿瘤侵袭转移的作用。为阐明黄芩素抗肿瘤的作用机制提供了新的研究思路。其详细确切机制仍需进一步深入研究。与此同时SATB1的表达可也作为一个新的工具，以评估乳腺癌的恶性程度，并且有望成为新的治疗靶点。

1 Friedenreich CM.Physical activity and breast cancer:review of the epidemiologic evidence and biologic mechanisms[J].Recent Results Cancer Res,2011,188:125-139.

2 Ahmad A,Hart IR.Mechanisms of metastasis[J].Crit Rev Oncol Hematol,1997,26(3):163-173.

3 Sporn MS.The war on cancer[J].Lancet,1996,347(9012):1377-1381.

4 Wang M,Yin B,Matsueda S,et al.Identification of special AT-rich sequence binding protein 1 as a novel tumor antigen recognized by CD8+T cells:implication for cancer immunotherapy [J].PLoS One,2013,8(2):e56730.

5 Cai S,Han HJ,Kohwi-Shigematsu T.Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1[J].Nat Genet, 2003,34(1):42-51.

6 Kohwi-Shigematsu T,Poterlowicz K,Ordinario E,et al.Genome organizing function of SATB1 in tumor progression[J].Semin Cancer Biol,2013,23(2):72-79.

7 Galande S,Purbey PK,Notani D,et al.The third dimension of gene regulation:organization of dynamic chromatin loopscape by SATB1[J].Curr Opin Genet Dev,2007,17(5):408-414.

8 Pavan Kumar P,Purbey PK,Sinha CK,et al.Phosphorylation of SATB1,a global gene regulator,acts as a molecular switch regulating its transcriptional activity in vivo[J].Mol Cell,2006,22(2): 231-243.

9 Ahlfors H,Limaye A,Elo LL,et al.SATB1 dictates expression of multiple genes including IL-5 involved in human T helper cell differentiation[J].Blood,2010,116(9):1443-1453.

10 Satoh Y,Yokota T,Sudo T,et al.The Satb1 protein directs hematopoietic stem cell differentiation toward lymphoid lineages[J].Immunity,2013,38(6):1105-1115.

11 Wang L,Ling Y,Chen Y,et al.Flavonoid baicalein suppresses adhesion,migration and invasion of MDA-MB-231 human breast cancer cells[J].Cancer Lett,2010,297(1):42-48.

12 Chiu YW,Lin TH,Huang WS,et al.Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,255(3):316-326.

13 Takahashi H,Chen MC,Pham H,et al.Baicalein,a component of Scutellaria baicalensis,induces apoptosis by Mcl-1 down-regulation in human pancreatic cancer cells[J].Biochim Biophys Acta, 2011,1813(8):1465-1474.

14 Lee Y,Yeo H,Liu S-H,et al.Increased anti-P-glycoprotein activity of baicalein by alkylation on the A ring[J].J Med Chem,2004,47 (22):5555-5566.

15 Ding D,Zhang B,Meng T,et al.Novel synthetic baicalein derivatives caused apoptosis and activated AMP-activated protein kinase in human tumor cells[J].Org Biomol Chem,2011,9(21):7287-7291.

16 Po LS,Chen ZY,Tsang DS,et al.Baicalein and genistein display differential actions on estrogen receptor(ER)transactivation and apoptosis in MCF-7 cells[J].Cancer Lett,2002,187(1-2):33-40.

17 Huang S,New L,Pan Z,et al.Urokinase plasminogen activator/urokinase-specific surface receptor expression and matrix invasion by breast cancer cells requires constitutive p38alpha mitogen-activated protein kinase activity[J].J Biol Chem,2000,275(16):12266-12272.

18 Wang CZ,Li XL,Wang QF,et al.Selective fraction of Scutellaria baicalensis and its chemopreventive effects on MCF-7 human breast cancer cells[J].Phytomedicine,2010,17(1):63-68.

19 Han HJ,Russo J,Kohwi Y,et al.SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis[J].Nature,2008,452(7184):187-193.

20 Zhang J,Zhang B,Zhang X,et al.SATB1 expression is associated with biologic behavior in colorectal carcinoma in vitro and in vivo [J].PLoS One,2013,8(1):e47902.

（2013-12-05收稿）（2014-02-22修回）

（本文编辑∶周晓颖）

Effect of Baicalein on the expression of SATB1 in MDA-MB-231 cells

Shuqun ZHANG,Xiaoyan GAO,Xinghuan XUE,Yinan MA,Xingcong MA
Correspondences to:Shuqun ZHANG;E-mail:zhangshuqun1971@aliyun.com

Objective:To investigate the effect of Baicalein on SATB1 expression and its relation to proliferation,invasiveness and migration of MDA-MB-231 cells.Methods:Colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) and wound healing assays were used to detect the cell proliferation and the migration changes of MDA-MB-231 cells when treated with different concentrations of Baicalein.SATB1 expression in MDA-MB-231 cells was detected by Western blot.Results:Along with the reaction time and increase drug concentration,the inhibitory effect of Baicalein on proliferation and migration of MDA-MB-231 cells gradually increased in a time-and dose-dependent manner(P＜0.05).After treatment with Baicalein for 48 h,an obvious decrease was observed in the level of SATB1 protein expression of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner(P＜0.05).Conclusion:Baicalein can suppress MDA-MB-231 cells growth and migration by inhibiting its proliferation in a time-and dose-dependent manner.It can also down-regulate the expression of SATB1.

Baicalein,SATB1,breast cancer,MDA-MB-231 cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20132064

张淑群 医学博士，副主任医师，副教授，博士、硕士研究生导师，研究方向为乳腺癌的中药干预。

西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤科（西安市710004）

*本文课题受国家自然科学基金面上项目（编号：81274136）、西安交通大学交叉项目基金（编号：Xjj2012141）和西安交通大学第二附属医院人才基金（编号：RCCGG201105）资助

张淑群 zhangshuqun1971@aliyun.com

E-mail∶zhangshuqun1971@aliyun.com