王 彬，刘 明，郝清智，宋福晨，李 霞

深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）年发病率约1.0‰[1]，急性期容易出现肺栓塞而危及生命，慢性期因静脉瓣膜破坏导致患肢肿胀、淤积性皮炎、顽固性小腿溃疡等后遗症。研究证实，DVT 模型大鼠存在细胞因子网络失衡的现象[2]，但导致这一现象的免疫学根源尚未明确。血管内皮是循环T细胞最早接触的场所，受T 细胞亚群及其产生细胞因子的直接作用，T 细胞亚群分化失衡可直接损伤血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC），损伤的VEC 又可招募并激活更多T 细胞，从而放大炎症损伤。我们于2011 年1 月—2012 年6 月，通过观察DVT 患者外周血Th1、Th2 细胞比例变化及血浆中Th1、Th2细胞特征因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（Interleukin-4，IL-4）和白介素-10（Interleukin-10，IL-10）水平，探讨Th1、Th2 亚群在DVT 发病中的作用及消栓通脉颗粒治疗本病的靶点与机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入病例标准为急性期混合型单纯下肢深静脉血栓形成[3]，单侧肢体发病，病程在15 d以内。排除不符合上述标准及有出血性疾病或出血倾向者。本组共60例，随机数字表法分为中西医结合组（结合组）和西药组。结合组30 例，男14例，女16 例；年龄（52±11）岁。西药组30 例，男19例，女11 例；年龄（50±13）岁。2 组发病部位、发病时间比较无显著差异（P ＞0.05）。选取同期健康查体者30 例，纳入正常组，男16 例，女14 例；年龄（44±12）岁。3 组间年龄、性别比较无显著差异（P＞0.05）。

1.2 药物及试剂 消栓通脉颗粒由茵陈、金银花、赤小豆、桃仁、黄柏等药物组成，具有清热利湿、祛瘀通络功效，由山东中医药大学附属医院药学部生产（鲁药制字Z0120030051），每包10 g。尿激酶丽珠制药厂生产，国药准字H44020645，每支10万U。低分子肝素钙注射液葛兰素史克公司生产，进口药品注册证号H20080480，每支0.4 mL：4100AxaIU。RPMI1640 (Gibco 公司)，离子霉素和莫能霉素均购自Sigma公司。TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10抗体均购自美国BD公司。

1.3 主要仪器 高速低温离心机(SORVALL SUPER T21，USA)，流式细胞仪(BECKMAN，USA)。

2 方法

2.1 用药方法 西药组给予尿激酶20 万U 静滴，1次/d，连续用药14 d；低分子肝素钙4100 U 皮下注射，1 次/d，连续用药14 d。结合组在西药组用药的基础上口服消栓通脉颗粒，每次10 g，2次/d，连续用药14 d。

2.2 标本采集 空腹状态经肘静脉抽血4 mL，装入抗凝管中，分离血浆分装至EP 管，保存于-80 ℃冰箱，分离外周血单个核细胞用于流式细胞术检测。

2.3 Th1、Th2细胞比例的测定 标本以等体积PBS稀释，采用人淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞，RPMI1640 调整细胞浓度至2×106/mL，接种至24孔板，加入佛波酯(50 μg/L)、离子霉素(1 μM)和莫能霉素(500 μg/L)，37 ℃5%CO2细胞培养箱培养4 h。收集细胞根据计数等分为测定管和同型对照管，加入20 μL PE标记的鼠抗人CD4单抗，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤2次，固定液室温避光固定反应20 min，离心弃去上清，PBS 洗涤2 次。加入破膜剂进行细胞打孔利于细胞因子染色，离心弃去上清后予细胞因子染色。测定管分别加入FITC 标记的鼠抗人TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10，对照管加入同型对照，4 ℃避光孵育30 min，1×穿膜缓冲液洗2次，1×PBS 重悬细胞，转管，上机检测。Winmidi 2.9 分析Th1(CD3+CD4+IFNγ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)亚群占CD4+细胞百分比。

2.4 Th1、Th2 细胞特征细胞因子的检测 采用ELISA法，所有步骤均按照说明书进行，通过标准曲线求得血样中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度。2.5 观察指标 ⑴各组Th1、Th2 细胞比例及TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度。⑵肢围测定：混合型DVT患者大腿中段及小腿中段肢围变化明显，在治疗前及末次用药后测量患者髌骨上缘上15 cm大腿中段、髌骨下缘下15 cm处小腿中段肢围。

2.6 统计学分析 应用SPSS 11.5 软件，计量资料以均值±标准差(x±s)表示。采用One Way-ANOVA 方差分析，2 组间比较采用Turkey 法检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Th1、Th2细胞特征因子占CD4+细胞百分比及药物对其影响 治疗前结合组、西药组TNF-α、IFN-γ均高于正常组，IL-4、IL-10 均低于正常组（P ＜0.05）。治疗后西药组、结合组，TNF-α、IFN-γ低于治疗前（P ＜0.05）；IL-4、IL-10 高于治疗前（P ＜0.05）。治疗后结合组TNF-α、IFN-γ均低于西药组（P <0.05）；结合组IL-4、IL-10高于西药组（P＜0.05）。见表1。

3.2 中药复方对Th1/Th2 亚群比例的影响 治疗前，结合组、西药组Th1/Th2比值均高于正常组（P ＜0.05）。治疗后，西药组、结合组TNF-α/ IL-4、IFN-γ/IL-10 比值低于治疗前（P ＜0.05）。治疗后结合组TNF-α/ IL-4、IFN-γ/IL-10 比值低于西药组（P＜0.05）。见表2。

2.3 肢围比较 两组患者治疗后肢围均低于治疗前（P ＜0.05）；消栓通脉组肢围改善优于西药组 （P＜0.05）。见表3。

表1 3组外周血TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10占CD4+细胞百分比及药物对其影响（%，x±s）

表2 药物对3组外周血Th1/Th2比例的影响（x±s）

表3 两组患者治疗前后肢围比较（cm，x±s）

4 讨论

根据细胞分化和功能特征不同，CD4+T 细胞最初被分为两个功能亚群：辅助性T细胞1(Thl)和辅助性T细胞2(Th2)，分别执行不同的生物学功能。Th1细胞主要分泌TNF-α、IFN-γ和白介素-2（interleukin-2，IL-2），作为致炎性介质，可以增强细胞毒性T 细胞和NK 细胞的活性，从而促进细胞免疫应答。Th2 细胞主要分泌IL-4 和IL-10，作为抗炎介质，通过使B 淋巴细胞产生抗体发挥体液免疫作用。现代免疫学研究认识到T细胞是产生细胞因子的关键细胞群，其不同亚群产生不同细胞因子形成复杂的细胞因子网络，发挥核心免疫调节作用。T细胞表达种类繁多的受体，能敏感地对体内外刺激作出应答反应。T细胞亚群之间具有重要的相互调节的作用，同时它们又相互抑制，如IFN-γ可以抑制2型辅助性T淋巴细胞的分化，而Th2细胞分泌的IL-4 又能够抑制Th 细胞向Thl 细胞分化，进而避免了Th1 细胞的过度激活。正常的情况下，机体内的Th1/Th2亚群细胞的功能处于动态平衡之中[4-5]。

IFN-γ可以通过促进脂质沉积和诱导巨噬细胞聚集，诱导巨噬细胞凋亡，产生过量的单核细胞趋化因子-1（macophage/monocyte chemotactic protein1，MCP-1），导致内皮损伤而促进血管炎症反应。IL-4可以抑制IFN-γ的产生，同时抑制IFN-γ对巨噬细胞的活化作用，减轻炎症反应，增进Th0 细胞向Th2的分化[6-7]。IL-10可以抑制促炎细胞因子，下调单核细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞等靶细胞的炎性激活，从而抑制单核/巨噬细胞及平滑肌细胞表达TNF-α、IL-1、IFN-γ、MCP-1等促炎细胞因子，调节Th1/Th2平衡，抑制炎症反应，从而保护静脉内皮细胞[8]。

在DVT初期，我们可以观察到，Th1亚群比例明显高于正常组，Th2 亚群比例明显低于正常组，Th1亚群占主导地位。此时T细胞在MCP-1的作用下，与血管内皮细胞结合，以渗出的方式透过内皮细胞层进入内皮下，参与炎症反应，加重内皮损伤，促进了血栓形成[9-10]。经过治疗后，结合组及西药组Th1亚群比例降低，Th2亚群比例升高，肢围较治疗前改善明显，两组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

消栓通脉颗粒是著名周围血管病专家侯玉芬教授在临床上常用的有效中药制剂，具有清热利湿、祛瘀通络的功效。消栓通脉颗粒中茵陈、赤小豆清热利湿，行血消肿共为君药。赤芍药清热凉血，活血化瘀，水蛭破血逐瘀，通经消癥，黄柏清热燥湿，泻火解毒，三药相须配伍合而为臣药，既助君祛湿、清热、活血，又能凉血活血、破血祛瘀、软坚散结，使血脉通畅，水肿自消。山栀清热，苍术功擅燥湿健脾，桃仁、红花活血散瘀。诸药合用，共奏清热利湿，祛瘀通络，消肿止痛之功效，使湿化、热清、瘀祛，脉络通畅。我们的前期研究证实，DVT急性期炎性细胞因子表达增高，消栓通脉颗粒可以保护血管内皮细胞，降低炎性细胞因子表达[2,11]。本研究中，消栓通脉颗粒可以抑制TNF-α、IFN-γ转录，促进IL-4、IL-10表达，升高Th2 亚群比例，优势诱导T 细胞向Th2 亚群偏移，减轻炎症反应，保护血管内皮细胞，促进血栓再通，改善肢体肿胀。但该复方疗效物质基础尚不明确，有待于进一步研究。

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