陈美元

（福建省农业科学院食用菌研究所，福州 350014）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）杂交菌株As2796是福建省蘑菇菌种研究推广站（现福建省农科院食用菌研究所）选育成功的优良商业蘑菇菌株，多年来一直占据中国双孢蘑菇栽培面积的80%以上[1]。在该菌株多年的保藏复壮、生产供应的过程中偶然发现了 2株退化突变体 2796-3和2796-5。它们在PDA培养基上生长基本正常，但在粪草培养基、棉籽壳培养基和麦粒培养基上均无法正常生长，在基质特别是多糖类基质的降解能力上发生了严重的变异和退化现象。这样的变异菌种如果流入市场，在 PDA斜面上不断扩繁成一级母种，而在生产季节却不能及时制作成二级种和三级种，将造成供种单位和制种户极大的经济和信誉损失，并将直接损害广大菇农的利益。经研究，我们排除了病毒等微生物感染的因素，证明了该退化性状是基因变异所引起的，并且可以稳定遗传。

由于 As2796菌株的重要性以及它所具有的双孢蘑菇商品化杂交菌株的代表性，除了在保藏和供种等方面应加强检测外，对已发现的该退化现象进行相关基因表达差异及分子机制研究具有重要的理论与实际意义。在前期研究中，我们对双孢蘑菇 As2796正常菌株及其两个退化突变体进行了mRNA差异显示（DDRT-PCR）分析[2]，发现有 9个片段存在明显的上调或下调差异表达，序列分析发现9个差异片段代表了5个基因的差异，它们在双孢蘑菇基因组数据库中的代码分别为 191327、199816、135047、193267、193513。在本研究中，我们对三个菌株中的这5个基因及其上游部分调控序列进行克隆与测序比较，以期获得这些基因与上游序列在三个菌株中的差异，并进一步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）菌株。双孢蘑菇杂交菌株As2796及其退化突变体菌株2796-3、2796-5由福建省农科院食用菌研究所种质资源与遗传育种研究室保藏并提供。大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α购自上海生工生物工程服务有限公司。

（2）试剂。Wizard SV Gel and PCR Clean-up System （DNA 胶纯化试剂盒）、pGEM-T Easy Vector System （PCR产物克隆试剂盒）及 SV Minipreps DNA Purification System（质粒提取试剂盒）购自Promega公司，PCR扩增试剂盒、DNA Markers及其它试剂均购自上海生工生物工程服务有限公司。

（3）引物。①差异基因编码序列扩增引物：根据DDRT-PCR分析中获得的5个差异基因［2]在双孢蘑菇转录组数据库中的编码序列（CDS）设计正反向PCR引物，用于扩增cDNA中的编码序列，也可扩增DNA中含内含子的编码序列，引物名称中的数字与 DDRT-PCR中的差异片段编号相同，且对应基因编号 191327、199816、135047、193267、193513。引物序列见表 1。②差异基因上游调控序列扩增引物：根据DDRT-PCR分析中获得的5个差异基因[2]在双孢蘑菇基因组数据库中的上游序列设计正反向PCR引物，用于扩增DNA中差异基因上游约1 200 bp的调控序列，引物名称中的数字与DDRT-PCR中的差异片段编号相同，且对应基因编号191327、199816、135047、193267、193513。引物序列见表2。

表1 差异基因编码序列扩增引物

表2 差异基因上游序列扩增引物

1.2 试验方法

（1）菌丝的培养。菌种接入常规PDA斜面培养基，24 ℃培养三周。

（2）总DNA的提取。按美国Sylvan公司提供的方法并加以改进[3]。

（3）目的 DNA片段的扩增。按文献［4]的方法稍加改动。总体积20 μL反应体系中含：10×buffer 2 μL；dNTPs （总 2.5 mmol/L）1.5 μL；模板 DNA（15～20 ng/μL）2 μL；正反向特异引物（约 10 μmol/L）各 1 μL；Pfu（0.5U/μL）2 μL；纯水10.5 μL。混匀后在台式离心机上稍加离心，放入PCR仪进行下列循环：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 Cycles；72 ℃10 min；4 ℃保持。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，GeneFinder荧光染料染色拍照。

（4）目的DNA片段的纯化、克隆与鉴定。按照 Promega公司 Wizard SV Gel and PCR Clean-up System、pGEM-T Easy Vector System和SV Minipreps DNA Purification System试剂盒说明书进行。

（5）克隆子测序与分析。克隆子质粒DNA送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得的片段序列用DNAMAN软件进行序列拼接与序列比对。

2 结果与分析

2.1 正常与退化菌株差异基因及其上游序列的扩增与克隆

以双孢蘑菇As2796及其2个退化菌株的总DNA为模板，用设计合成的10对特异引物对5个差异基因带内含子的编码序列及其上游约 1 200 bp调控序列进行扩增，结果均获得了目标条带（图1，图2）。割取这些条带并进行纯化，然后克隆到pGEM-T Easy载体中。

2.2 正常与退化菌株差异基因及其上游序列的测序及比较

图1 3个菌株5个差异基因带内含子CDS的PCR扩增图

图2 3个菌株5个差异基因上游序列的PCR扩增图

图3 差异基因199816在3个菌株中的序列比较

对克隆子质粒进行测序与序列拼接，比较3个菌株间的序列，结果表明除了差异基因199816在3个菌株中的序列完全一致外（图3），其余基因与上游序列在三个菌株中均有几个碱基的差异（图4）。而这些差异在2个退化菌株中的表现未必一致，重复扩增与测序的结果也显示这些差异并无明显的规律性和重复性。因此它们应是PCR扩增及测序过程中产生的误差，而非实质性差异。

图4 差异基因135047上游序列在3个菌株中的序列比较

3 讨 论

食用菌菌种在保藏、制种及后续的栽培过程中，时有发生长势变差、出菇延迟、产量下降、品质劣变、抗性减弱等现象，这些现象人们泛称“退化”。 我国是食用菌生产大国，而食用菌菌种的退化又是一个较为常见的现象，因此国内针对食用菌生产上的退化现象有较多的综合性报道，内容包括食用菌菌种退化与老化的现象，可能的因素及防止措施。其中提到退化因素可能有遗传变异、病毒或杂菌污染、无限传代、营养不良、保藏不当、人工选择偏差等内外因[5～7]。但在食用菌的退化机理研究方面，除了本实验室对双孢蘑菇的丛生变异与基质降解能力退化现象有关于基因变异的初步研究和公开报道[2，8，9]，以及Magae等[10]在金针菇和Qiu等[11]在平菇中发现dsRNA病毒感染可导致性状退化外，未见其他食用菌退化的相关基因与分子机理研究的文献报道。

我们的研究首次发现一些在双孢蘑菇基质降解能力退化菌株中差异表达的基因，但这些基因及其上游序列在三个菌株中未能发现可重复的实质性差异。结合DDRT-PCR结果我们判断正常与退化菌株的这些基因在转录上存在量的差异。但结构基因本身及其上游调控序列并未发生实际的变异，退化更可能是影响胞内信号传导或基因转录过程的调控蛋白基因变异引起的。这为进一步深入研究双孢蘑菇分解基质能力退化的分子机理奠定了基础。

［1]王泽生，廖剑华，陈美元.我国双孢蘑菇育种研究与产业发展［J].食用菌学报，2010，（增刊）：19-20.

［2]陈美元，王泽生，廖剑华，等.双孢蘑菇基质降解能力退化的 DDRT-PCR分析［J].菌物学报，2010，29（5）：707-712.

［3]陈美元，廖剑华，卢政辉，等.双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析［J].菌物学报，2007，26（增刊）：128-137.

［4]陈美元，廖剑华，王波，等.中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析［J].食用菌学报，2009，16（1）：11-16.

［5]丁湖广.菌种退化与老化原因及防止措施［J].特种经济动植物，2006，1：39-40.

［6]刘海英，董月香，周廷斌，等.食用菌菌种的退化及复壮［J].食用菌，2003，25（6）：16-17.

［7]Fritsche.G..Maintenance Rejuvenation and Improvement of HORST-U1［J].Genetic and Breeding of Agaricus，1991：145-152.

［8]陈美元，王泽生，廖剑华，等.双孢蘑菇丛生变异的RAPD分析及差异DNA片段的克隆［J].厦门大学学报（自然科学版），2003，42（5）：657-660.

［9]陈美元，王泽生，廖剑华，等.双孢蘑菇基质降解能力退化的差异蛋白质组学分析［J].菌物学报，2011，30（3）：508-513.

［10]Magae Y，Hayashi N.Double-stranded RNA and virus-like particles in the edible basidiomycete Flammulina velutipes （Enokitake） ［J].FEMS Microbiol Lett.，1999， 180（2）：331-5.

［11]Qiu L， Li Y， Liu Y， et al.. Particle and naked RNA mycoviruses in industrially cultivated mushroom Pleurotus ostreatus in China［J]. Fungal Bio.， 2010，114（5-6）： 507-13.