陈志宏 陈炳智 谢宝贵 刘新锐

（福建农林大学生命科学学院菌物研究中心，福州 350002）

金福菇（Tricholoma lobayense Heim）是一种高温型食用菌，适合夏季出菇。它与草菇、灵芝、毛木耳等高温型或中高温型食用菌一样，菌种在低温（4 ℃）下保藏，经常出现菌种死亡问题，而在室温下保藏则易出现菌种老化。菌种保藏的目的是保持良种的优良种性，它是良种保护的重要环节。一般地，菌种处于生长状态，易出现老化，也易发生变异，菌种保藏技术研究就是为了开发出一种保藏方法，使菌种处于休眠状态，既不生长也不死亡，以避免变异与老化。目前尚未见到金福菇菌种保藏技术的相关报道，而液氮超低温保藏菌种已被公认为是保持菌种特性不变和存活力持久最为理想的方法［1，2]，我们通过对金福菇菌种液氮保藏效果的降温速率、解冻温度两个方面进行研究，探索金福菇菌种的液氮保藏技术，以期应用于金福菇种质资源的保藏。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 金福菇“Tr0005”和“Tr0001”两个菌株均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供。

1.2 菌种培养与保藏管制作 聚丙烯饮料管剪成5 cm长，用火焰先把一端溶化封口，灭菌后备用。将已活化2次的PDA平板菌种用小号打孔器截取菌种块，挑放于无菌聚丙烯饮料管，注入10%甘油，再用火焰封口，静置过夜。

1.3 降温程序设计 将制备好的保藏管用CryoGenesis（TM）V5程序降温仪进行4个不同降温程序处理试验（表1），每个程序3个重复，35 ℃解冻。

表1 液氮保藏不同降温程序处理

1.4 解冻温度试验 从液氮罐取出表1所列的C降温程序处理，保藏3个月后的金福菇菌种，设置4个解冻温度，即室温（25 ℃左右）、30 ℃、35 ℃、40 ℃，解冻时间为5 min，每个解冻处理设3个重复。

1.5 保藏效果评价方法 液氮保藏 3个月后的金福菇菌种经解冻，菌种块用无菌滤纸吸干防冻剂，接种于PDA平板上，每个处理3个重复，28 ℃培养，记录菌丝萌发时间，统计萌发率，测量菌丝的日生长速度，观察菌落特征。

2 结果与分析

2.1 不同降温程序对液氮保藏效果的影响 对试验菌株按4种不同降温程序降温预处理后投入液氮中冷冻保藏3个月，解冻后，活化培养9天，测量数据、拍照。试验结果（图1、表2）表明，菌种从25℃降到4 ℃的降温速度很重要，直接放入液氮中，降温速度太快，菌种易死亡。适合的降温速度为7 ℃/min。

图1 不同程序降温保藏的菌种生长情况

表2 不同降温程序降温液氮保藏的效果比较

2.2 不同解冻温度对液氮保藏效果的影响 经3个月的液氮冷冻保藏，经不同解冻温度处理解冻后活化培养10天，测量数据、拍照。结果（表3）表明：液氮保藏后，通过不同解冻处理方法，菌株萌发时间、萌发率、生长速度有差异。35℃解冻的菌株萌发时间较短，生长速度较快，菌丝浓密。30℃解冻的菌株次之，室温下自然解冻与 40℃条件解冻的菌株萌发率低，生长速度慢。

表3 不同解冻温度与液氮保藏效果的关系

3 讨 论

自1968年Hwang首先应用液氮保藏食用菌菌种以来，液氮保藏因其具有的突出优点而被广泛应用[1，3]。但有报道不同食用菌品种菌株因未对液氮保藏的降温程序条件进行优化，导致保藏后仍出现菌种退化和品质下降[4，5]。本试验还对福建省食用菌种质资源保藏中心的另外2个菌株Tr0007、Tr0013等进行降温程序、解冻温度方面的液氮保藏试验进行优化，其保藏后的检测结果（具体数据略）与本文试验菌株的表现规律相一致，只是在同一保藏条件下存在微小的菌株间的差异。

本研究结果表明，金福菇菌种经程序降温后的保藏效果比直接放进液氮罐中好，萌发时间短，菌丝生长快且浓密。先从室温以7 ℃/min降至4 ℃，再以1 ℃/min降至—40 ℃效果最好。金福菇菌种在保藏后还需要一定的温度进行解冻，以 35 ℃解冻后的菌株萌发时间较短，且生长速度较快，菌丝浓密。而影响金福菇菌种液氮保藏效果的因素还较多，如菌种的菌龄和培养基质等，尚需要作进一步的优化研究。

［1]黄河，徐大雅.液氮保存疫霉属菌种存活期检测［J].真菌学报，1993，12（1）：48-53.

［2]Gerardo Mata， Rosalía Pérez-Merlo. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant［J]. Cryobiology， 2003， 47：14-20.

［3]刘新锐，叶夏，王玉青，宋秀高，陈传明，谢宝贵.香菇菌种液氮保藏技术研究［J].热带作物学报，2011，32（7）：1360-1363.

［4]曾辉，王泽生.食用菌菌种保藏研究进展［J].中国食用菌，1994，13（5）：5-6.

［5]陈燕妍.超低温冻结保藏担子菌［J].真菌学报，1987，6（2）： 110-117.