林 巍，李继昌，蒋 红，刘晓兰

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161006；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

黏菌素（colistin）是由多黏芽孢杆菌培养液中获得的碱性多肽类抗生素，对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用，临床常用其硫酸盐。黏菌素存在的5个游离氨基可与哺乳动物细胞膜上带阴性电荷的磷脂结合，引发动物的毒副作用（包括神经毒性和肾毒性）［1］。背根神经节分散存在于外周神经系统，定位于和脊髓紧密相连的脊神经根上，DRG富含周围神经系统的感觉神经元，是外周和中枢纤维联系的一个重要中继站，在神经系统中起着重要作用，是研究黏菌素神经毒性机制理想的神经元。体外细胞毒性试验具有快速、简便和成本低的特点，是研究药物神经毒性的评价的主要方法。目前未见使用体外神经细胞研究硫酸黏菌素毒性的报道，本试验通过培养原代背根神经元细胞，观察在不同浓度的硫酸黏菌素作用下的细胞毒性效应，以期能了解硫酸黏菌素对背根神经细胞的毒性作用，为丰富硫酸黏菌素的毒理学资料，预防硫酸黏菌素的神经毒性和安全使用硫酸黏菌素治疗多重耐药革兰阴性菌感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 新生小鼠（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供）。DMEM/F12培养基、B－27添加剂、胎牛血清及Ⅳ型胶原酶，购自Gibco公司；硫酸黏菌素、胰蛋白酶、TritonX－100、胰岛素、多聚甲醛和多聚赖氨酸（PLL），购自Sigma公司；一抗抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体和即用型山羊血清封闭液，购自博士德公司；羊抗兔荧光二抗，购自北京中杉生物科技公司；β－NGF，购自Biomed公司；层粘蛋白，购自Biosciences公司；尼氏染液，购自上海微晶生物技术有限公司。

1.2 培养基配制 无血清全培养基为DMEM/F12培养基，包含2%B－27添加剂，0.25μg/mL胰岛素，10ng/mLβ－NGF。在超净台中，0.01%多聚赖氨酸包被96孔板，4℃过夜，无菌水洗2次，晾干。加入0.001%层粘蛋白37℃包被4h，晾干后待用。

1.3 原代背根神经元细胞的分离培养 取3日龄新生小鼠，75%酒精浸泡后放入无菌平皿中，切除头部，用剪刀沿腹部剪开，去除内脏，翻至背侧沿背部皮肤剪开，去除皮肤后从颈部椎管开口将椎管剪开，再从腹侧将脊柱剪成两部分，显微镊夹起一侧脊柱，轻轻将脊髓挑出，暴露出椎间孔中的背根神经节，用镊子逐一摘取神经节，放入4℃预冷的PBS中。修剪神经节，去除神经丝。PBS清洗后，剪碎神经节，加入Ⅳ型胶原酶37℃消化1h，离心去掉胶原酶，加入0.25%胰酶37℃消化15min，FBS终止消化，离心去掉胰酶，加入DMEM/F12培养基吹打5～10次，离心去掉培养基加入0.25%胰酶继续消化10 min，FBS终止，用无血清全培养基吹打成细胞悬液，细胞计数，接种到事先包被好的培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养。

培养24h后，大部分DRG细胞已经贴壁，加入阿糖胞苷作用24h，换新培养基继续培养，观察，记录细胞的形态和生长状态。

1.4 原代背根神经元细胞的鉴定

1.4.1 尼氏染色鉴定 取培养4d后的DRG细胞吸除培养液，0.01mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温下固定15min。蒸馏水洗涤2次，每次2 min。尼氏染色液37℃染色15min。蒸馏水洗涤2次，每次2s，95%乙醇约3～5s，70%乙醇洗涤2次，每次2min。显微镜下观察，照相。

1.4.2 NSE荧光染色鉴定 将培养4d后的DRG细胞吸除培养液，0.01mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温下固定15min。PBS洗涤2次，每次3 min，0.2%TritonX－100透化5min，PBS洗涤2次，每次3min，羊血清封闭1h，NSE一抗（1∶200）4℃过夜，PBS洗3次，每次8min，FITC标记荧光二抗（1∶50）室温避光作用30min。PBS洗3次，每次8 min，显微镜下观察，照相。

1.5 原代背根神经元细胞毒性测定 DRG细胞培养4d后，加入DMEM/F12培养基配制的硫酸黏菌素溶液，使细胞培养液中硫酸黏菌素终浓度为800 μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400 μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和1μg/mL，每个浓度6个平行孔。同时设6孔阴性对照。37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，显微镜观察染毒后细胞的形态变化，同时MTT法测定硫酸黏菌素对DRG细胞的存活率。每孔细胞加入20μL的MTT溶液（5 mg/mL，DMEM 溶解），轻轻混匀，37℃，5%CO2培养箱中继续培养4h，取出，弃上清，每孔加150μL DMSO，500r/min振荡5min，用酶标仪在490nm下测定吸光度值（OD值），计算细胞存活率，细胞存活率＝试样吸光度值/阴性对照吸光度值。

1.6 数据处理 根据体外细胞培养试验结果，计算不同浓度硫酸黏菌素对细胞的抑制率，用SPSS 13.0软件建立简单线性回归方程，计算细胞的半数抑制浓度。

2 结果

2.1 原代背根神经元细胞的形态学观察 培养24 h后大部分细胞已经贴壁，DRG细胞较大，胞体呈圆形，周围有光晕并长出小突触；细胞长到第3天和第4天时，胞体饱满，细胞呈现明显的多样性，多为圆形、椭圆形和三角形，胞体体积较大，光晕明显，突起发达，并且有许多分支，互相交织呈网络状（见中插彩版图1）。

2.2 原代背根神经元细胞的尼氏染色鉴定 培养4d的DRG神经元进行尼氏染色后，发现块状或颗粒状尼氏体分布在大部分神经元的胞浆内，呈深紫色，数目较多，细胞核不着色，表明培养的DRG神经元生成状态良好（见中插彩版图2）。

2.3 原代背根神经元细胞的NSE荧光染色鉴定培养4d的DRG神经元经NSE免疫荧光反应，荧光显微镜下可见神经元特异性表达的蛋白NSE阳性反应物呈明亮的绿色荧光，反应物主要分布在胞体和神经突起上，细胞核不着色。NSE阳性细胞，形状为圆形，椭圆形，多边形等，神经细胞有较多突起，交织呈网状（见中插彩版图3）。

2.4 硫酸黏菌素对原代背根神经元细胞形态影响由中插彩版图4和5可见，大剂量硫酸黏菌素可致DRG神经元细胞发生病变，表现为细胞固缩，聚集成团，折光性差，突起减少，胞浆空泡化，细胞大量死亡。

2.5 硫酸黏菌素对原代背根神经元细胞存活率测定 由表1可知，当硫酸黏菌素浓度低于10μg/mL时，对细胞存活率无明显影响；当硫酸黏菌素浓度达到10μg/mL时，能够降低DRG神经元细胞的存活率，并且随硫酸黏菌素浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，对DRG神经元细胞产生细胞毒性，抑制细胞生长；当硫酸黏菌素浓度达到200μg/mL时；细胞存活率降到50%左右，一半细胞死亡；当硫酸黏菌素浓度达到600μg/mL时，DRG细胞存活率降到10%左右，几乎没有存活的细胞。试验结果说明，大剂量的硫酸黏菌素有很强的细胞毒性，能够引起细胞病变和死亡。根据硫酸黏菌素对DRG神经元细胞的抑制率，计算出硫酸黏菌素对DRG神经元细胞的IC50为222.7μg/mL，95%可信区间为193.4～252.9μg/mL（SPSS 13.0软件）。

表1 MTT法测定硫酸黏菌素对DRG细胞毒性

3 讨论

目前对于背根神经节神经元细胞的培养多采用怀孕14～16d胚胎大鼠［2－3］，取材方式大体分为连同脊髓同时提取的方式和逐个摘取神经节。本试验参照文献报道的DRG细胞培养方法［4－6］并略作改进，选用新生3d的小鼠取材，并在低温下操作，尽量保证了组织的存活。背根神经节的获取，采取传统的取材方法，肉眼观察下，分别打开前后椎板，用医用眼科镊子，逐一夹取椎间孔中的神经节，反复练习后，该方法可熟练摘取足够数目的神经节，能够满足试验要求。背根神经节神经元是一种高度分化的细胞，在发育的晚期即失去分裂增殖能力，对生存条件要求也较高，需要接种在支持物上或加入生长因子才能生长。本试验使用多聚赖氨酸联合层黏蛋白进行预包被培养DRG神经元，同时在全培养基中添加了神经生长因子β－NGF和B－27，所获得的DRG神经元生长状态良好，细胞有明显光晕，轴突发达，形成网络。另外，本试验的后期进行抗生素毒性试验，因此在前期培养过程中未使用抗生素。

细胞半数抑制浓度（IC50）是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中，就是以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度为IC50。除此以外，半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值，作为反映药物毒性效应的定量指标，在各种药物毒性的筛选中广泛应用。体外方法有助于预测药物急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。本试验用新生小鼠背根神经元建立原代细胞培养，测得硫酸黏菌素对DRG神经元的IC50为222.7 μg/mL，为评估体内毒性浓度和安全用药提供了毒理学数据。

由试验可知，大剂量硫酸黏菌素可致DRG神经元细胞发生病变，使细胞内出现大量空泡，引起细胞死亡，出现明显的细胞毒性，而低于10μg/mL剂量组没有明显的细胞毒性。据文献报道［7－8］，硫酸黏菌素对革兰阴性细菌的最小杀菌浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，在该浓度范围内，硫酸黏菌素对DRG神经元存活率没有明显的影响作用。只有硫酸黏菌素浓度达到最小杀菌浓度5～20倍（10μg/mL）以上时，才对DRG神经元存活率有一定影响。所以推测在正常杀菌浓度下单次使用硫酸黏菌素，应该不会对神经细胞有损伤。大剂量反复使用硫酸黏菌素时，则需要注意是否会导致神经细胞的损伤和引发神经毒性。大剂量硫酸黏菌素是如何导致神经细胞损伤和死亡的机制还需进一步探讨。

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